تطوير نظام تسليم الاقتصادية DNA من قبل "Acufection" وتطبيقه لبحوث الجلد
Summary
هذا البروتوكول هو بديلا فعالا من حيث التكلفة للتعبير عارية DNA البلازميد في الجلد الماوس. ويتمثل الهدف العام من البروتوكول هو تقديم الجينات المرتبطة بالمناعة في أنسجة الجلد لتحديد الدور الوظيفي للجين معين في التهاب الجلدي.
Abstract
ويرتبط التقلبات من الاستجابة المناعية في الجلد مع العديد من اضطرابات الجلد البشري. النقل المباشر للجينات المرتبطة بالمناعة في أنسجة الجلد هو نهج رائعة للتحقيق في تعديل المناعي للالتهاب الجلدي في نماذج الماوس من الأمراض التي تصيب الإنسان. هنا نقدم بروتوكول فعالة من حيث التكلفة التي سلمت DNA عارية في الجلد الماوس ويؤدي إلى التعبير التحوير. وصاغ طريقة "acufection"، تدل على ACU بوساطة ثقب DNA fection غير المشبعة. لأداء acufection، وقد أكسب الجلد الماوس أولا مع الحمض النووي في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثم وخز باستخفاف مع مجموعة من الإبر الوخز بالإبر لتسهيل امتصاص الحمض النووي وترنسفكأيشن إلى الخلايا. يتم أخذ DNA البلازميد يفترض من قبل الخلايا الكيراتينية والخلايا الجذعية (DCS) في الجلد وأعرب في البروتين. لم وخز الميكانيكية مع الإبر في حد ذاته لا يسبب تلف الجلد أو تتسبب في تنشيط الخلايا الكيراتينية. التعبيرمن الجينات transfected تم الكشف في الجلد على المستويين النسخي ومتعدية التالية acufection لمدة 2 يوما، والحفاظ على ما يصل إلى 7 أيام. وكان الهدف الأساسي لتطوير هذه الطريقة acufection للتحقيق في شكل الإسوي غير معروف سابقا من IL-15. باستخدام هذه الطريقة، وهي تقسم بدلا من ذلك IL-15 الإسوي مع حذف جزئيا اكسون 7 (IL-15ΔE7) وأعرب في الجلد وعلاجه في وقت لاحق مع تول مثل مستقبلات 7 (TLR7) ناهض، إميكويمود (IMQ)، للحث على التهاب. Acufection-تسليمها IL-15ΔE7 في الجلد قمع انتشار الخلايا الكيراتينية، سمك البشرة والتوظيف العدلات في التهاب الجلدي الناجم عن IMQ. مع تزايد الاهتمام في تحديد الآليات التنظيمية للالتهاب الجلدي، وصفت بروتوكول هنا يوفر التكلفة بديل فعال وتنوعا للنظام مدفع الجينات أو microseeding للتسليم DNA في الجسم الحي. ومن المحتمل أن تكون قد تسمح باكتشاف وظيفة روايةجين في الجلد أو عن التحقيق في علاج جديد لأمراض الجلدية.
Introduction
الجلد هو خط الدفاع الأول المضيف. الكيراتينية (KCS) هي نوع من الخلايا الرئيسية في الجلد من البشر والفئران. في استجابة للمؤثرات البيئية (مثل ضوء الشمس والأكسجين والمواد الكيميائية والغزو المسببة للأمراض)، يتم تنشيط KCS وتنتج مجموعة واسعة من السيتوكينات و chemokines الموالية للالتهابات مثل IL-8، IL-6، IL-1α، IL-1β، TNF- α و GM-CSF 1. معا يؤدي تجنيد الخلايا المناعية للجلد. وكثيرا ما يرتبط تفاقم الالتهاب الجلدي مع العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان بما في ذلك التهاب الجلد التماسي خارج الرحم الحاد والمزمن T التهاب بوساطة الخلايا (مثل التهاب الجلد التماسي التحسسي والصدفية) 2. تحوير الردود الموالية للالتهابات في الجلد عن طريق تثبيط تفعيل KC هو نهج معقول لعلاج الالتهاب الجلدي. يصف هذا البروتوكول نهجا جديدا للتعبير عن عابر جين خلوى في البشرة، من أجل دراسة الدقة المناعةponse المترتبة على مثل هذا العلاج في الجلد.
البشرة يؤلف طبقة الأكثر سطحية من الجلد. وهو بمثابة حاجز مادي حفظ المواد الخارجية مثل الأحماض النووية ومسببات الأمراض من دخول الطبقات العميقة من الجلد. وقد وضعت العديد من التقنيات خالية من إبرة لنقل البشرة DNA 3 و 4. DNA في حل أو المرتبطة الجسيمات الشحمية الموجبة أو ناقلات اتش تم تطبيقها مباشرة على البشرة تعديلها مع تقنيات مثل إزالة الطبقة القرنية أو العلاج مع السماط كاشف. إزالة ظهارة متقرن تسهل DNA عبور حاجز البشرة والتفاعل مع الخلايا الكيراتينية والخلايا انجرهانز للحث على الاستجابات المناعية 5. في حين أن مساحة كبيرة متاحة لنقل الحمض النووي ولا ينطوي هذا النهج الإبر، وهناك عيوب بما في ذلك شرطلكميات كبيرة من الحمض النووي (10-100 ميكروغرام)، معاملة قاسية على الجلد عن طريق تجريد، والنتائج غير متناسقة في إحداث استجابة مناعية في الحيوانات تحصين دون تسليم DNA معززة 6. وقد تبين بوساطة Microparticle تسليم داخل الخلايا DNA عارية على الجلد لتكون فعالة للغاية وقابلة للتكرار لإحداث استجابة مناعية 7 و 8. وقد استخدم بندقية الجينات باليد لقصف الموقع المستهدف الجلد مع البلازميد جزيئات الذهب المغلفة DNA 2 ميكرون القطر في الحجم عن طريق تدفق الهواء الهيليوم المضغوط 9. يتم أخذ DNA البلازميد يفترض من قبل الخلايا الجذعية KCsand (DCS) في الجلد ويتم التعبير عن هذا البروتين محليا أو يتم نقلها إلى استنزاف الغدد الليمفاوية من البلدان النامية 10. على الرغم من أن نظام مدفع الجينات بسيط ويتطلب خبرة تقنية محدودة، تكلفة إعداد وتقديم "BUL DNAالسماح "(أي مساحيق الذهب، غاز الهيليوم) وللمدفع الجينات نفسها محدودة التطبيق العام فيها. بالإضافة إلى ذلك، شرط وجود نظام الهليوم تسليم الغاز يحد من سهولة النقل بندقية الجينات عندما تجرى التجارب في مواقع مختلفة. Microseeding وقد ثبت لتحقيق كفاءة أعلى من نقل الجينات من حقنة واحدة والقصف الجسيمات 11. Microseeding يستخدم بندقية الوشم لتقديم DNA على الجلد من دون استخدام الخرز الجسيمات 11. تتأرجح على الأرجح إلى microneedles على الجلد باستخدام هذا النهج تتخلص مباشرة غشاء الخلية، وبالتالي نقل الحمض النووي لخلايا متعددة في نفس الوقت، ولكن الألم الذي يصاحب عدد كبير من الحقن مع 0.254 مم الإبر قطرها هو وضع غير مؤات.
هنا نقدم نهجا بديلا لتسليم DNA في الجسم الحي. و"acufection" </strأونج> البروتوكول وصفنا هنا يوفر وسيلة اقتصادية وفعالة لتقديم DNA البلازميد في الجلد الماوس. لفترة وجيزة، كان لا بد عشر إبر الوخز بالإبر (0.2 ملم في القطر × 13 ملم في الطول) في حزمة بواسطة شريط لاصق. وضعت وحدة تخزين من 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 10 ميكروغرام من البلازميد التي تحتوي على التحوير من الفائدة على، مزيل الشعر الجلد الجناح المعالجة كريم حلق. باستخدام حزمة إبرة الوخز بالإبر إلى التأرجح السطح (1 سم × 1 سم) في الجلد، وقد خففت keratins في طبقة قرنية واستيعاب DNA البلازميد تطبيقها على السطح في البشرة. تم رصد تلف الجلد، ووجدت أن يكون الحد الأدنى. وأكد التعبير عن الجينات transfected في الجلد acufected من قبل كل من الكمية في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR) وELISA. وقد أظهرت الآثار تغييري المناعية لل-تسليمها acufection IL-15ΔE7 على الالتهاب الجلدي باستخدام نموذج الفأر المعالجة IMQ 12. بينما يثبت acufection أن يكون ديما سهلة وأقلnding طريقة لتسليم DNA في الجسم الحي، ومقدار الأمثل للDNA لجينات مختلفة والأوقات لوخز الجلد يجب أن يكون الأمثل بعناية للحصول على نتائج قابلة للتكرار.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الأكثر أهمية لضمان التعبير عن DNA البلازميد acufected هو التأرجح بالتساوي وتخفيف طبقة قرنية من الجلد. وفي الوقت الذي يدفع الإبر بلطف دون قطع الجلد، ويجب أن تكون القوة بالقوة الكافية لخفض السطح. لتسهيل امتصاص الحمض النووي في 10 ميكرولتر حل على 1 سم × مساحة 1 سم، يجب أن ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل منحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST 103-2633-B-002-002، 104-2320-B-002-048). نشكر الدكاترة. بيتي وو هسيه وشين كوو لي في جامعة تايوان الوطنية، ليه زيربوني في جامعة ستانفورد، والدكتور بيتر هوفمان في جامعة هاواي لقراءة المخطوطة، يون شيان في جامعة تايوان الوطنية للمساعدة التقنية، والدكتور ون تشي وي في الزراعة التكنولوجيا الحيوية مركز الأبحاث في أكاديمية سينيكا للحصول على المشورة الفنية.
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
Riferimenti
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5′ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes’ response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
