Desarrollo de un sistema de entrega de ADN económico por "Acufection" y su aplicación a la investigación de la piel

La piel es la primera línea de defensa del huésped. Los queratinocitos (KCS) son el principal tipo de células en la piel de los seres humanos y ratones. En respuesta a estímulos ambientales (por ejemplo la luz solar, oxígeno, productos químicos y la invasión patógena), KCS se activan y producen una amplia gama de citoquinas proinflamatorias y quimiocinas tales como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α y GM-CSF ^1. Juntos desencadenan el reclutamiento de células inmunes en la piel. Inflamación cutánea agravado a menudo se asocia con numerosas enfermedades humanas, incluyendo la dermatitis de contacto ectópico aguda y la inflamación mediada por células T crónico (por ejemplo, dermatitis de contacto alérgica y psoriasis) ^2. Modulación de las respuestas proinflamatorias en la piel inhibiendo la activación KC es un enfoque plausibles para tratar la inflamación cutánea. Este protocolo describe un nuevo enfoque para expresar transitoriamente un gen de citoquina en la epidermis con el fin de estudiar res inmunesPonse como consecuencia de un tratamiento de este tipo en la piel.

La epidermis se compone la capa más superficial de la piel. Sirve como una barrera física de mantenimiento de sustancias externas tales como ácidos nucleicos y patógenos entren en las capas más profundas de la piel. Varias técnicas libres de agujas han sido establecidos para la transferencia de ADN epidérmico ^{3, 4.} ADN en solución o asociado con liposomas catiónicos o los vectores de adenovirus se ha aplicado directamente a la epidermis modificados con técnicas tales como la eliminación de la capa córnea o el tratamiento con depilación reactivo. La eliminación del epitelio cornified facilita ADN de cruzar la barrera epidérmica y la interacción con los queratinocitos y células de Langerhans para inducir respuestas inmunes ^5. Mientras que una gran área de superficie está disponible para la transferencia de ADN y este enfoque no implica agujas, hay desventajas, incluyendo el requisitopara las grandes cantidades de ADN (10 – 100 mg), el tratamiento dura en la piel mediante separación por arrastre, y los resultados inconsistentes en la inducción de respuesta inmune en los animales inmunizados sin refuerzo suministro de ADN ^6. La administración intracelular de micropartículas mediada de ADN desnudo para la piel se ha demostrado ser altamente eficiente y reproducible para la inducción de respuesta inmune ^{7, 8.} Una pistola de genes de mano se ha utilizado para bombardear el sitio diana de la piel con el plásmido partículas de oro recubiertas de ADN 2 micras de diámetro de tamaño por medio de flujo de aire de helio presurizado ^9. El ADN plásmido se presumiblemente captado por las células dendríticas (DCs) KCsand en la piel y la proteína se expresa de forma local o siendo transportado a ganglios linfáticos de drenaje por DCs ^10. Aunque el sistema de pistola de genes es simple y requiere experiencia técnica limitada, el costo para la preparación y la entrega de los "bul de ADNdejar "(es decir, polvos de oro, gas helio) y para la pistola de genes se ha limitado su aplicación general. Además, el requisito de un sistema de suministro de gas helio limita la facilidad de transporte pistola de genes cuando los experimentos se llevan a cabo en diferentes lugares. microsiembra se ha demostrado que se obtiene una mayor eficiencia de la transferencia de genes de una sola inyección y el bombardeo de partículas ^11. microsiembra utiliza una pistola de tatuaje para administrar ADN a la piel sin el uso de perlas de partículas ^11. oscilante las microagujas en la piel usando este enfoque es probable que raspar directamente la membrana celular y por lo tanto la transferencia de ADN a múltiples células al mismo tiempo. Sin embargo, el dolor asociado con el gran número de inyecciones con agujas de 0,254 mm de diámetro es una desventaja.

Aquí proporcionamos un enfoque alternativo para la entrega de ADN in vivo. El "acufection" </strong> protocolo describimos aquí proporciona una manera económica y eficiente para entregar ADN plasmídico en la piel del ratón. Brevemente, diez agujas de acupuntura (0,2 mm de diámetro x 13 mm de longitud) fueron atados en un manojo por cinta adhesiva. Un volumen de 10! L de PBS con 10 g de ADN plásmido que contiene el transgén de interés se colocó en el afeitado, depilación piel flanco crema-tratada. Mediante el uso del haz de aguja de acupuntura para oscilar la superficie (1 cm x 1 cm) de la piel, las queratinas en la capa córnea se aflojaron y el ADN plásmido aplicado a la superficie fue absorbida en la epidermis. daño de la piel se controló y se encontró que ser mínimo. La expresión del gen transfectado en la piel acufected fue confirmada por tanto cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) y ELISA. Los efectos moduladores inmunes de acufection-entregado IL-15ΔE7 sobre la inflamación cutánea se demostraron usando el modelo de ratón IMQ tratados con ^12. Mientras acufection demuestra ser una dema fácil y menosmétodo Nding para la entrega de ADN in vivo, la cantidad óptima de ADN de diferentes genes y los tiempos para pinchar la piel tiene que ser optimizado cuidadosamente para obtener resultados reproducibles.