小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

ハイスループットスクリーニング（HTS）が広く新しい治療分子の同定のため、または新しい医学的適応症におけるFDA承認薬物の再配置のために採用実績のある戦略です。 ^1はこれまでのところ、達成HTSの成功は、以前に発見された薬の茄多によって測定することができます。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブは、乳癌、シタグリプチンの治療のために使用されます。ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）阻害剤、抗高血糖薬として使用され、慢性骨髄性白血病の治療のために使用される経口BCR-ABLチロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブは、もともとによって発見され承認された薬物の長いリストのいくつかの例を表していますHTS。製薬業界の生産は最近、新しい化学物質の発見で不足に苦しんできたが^2、成功した薬剤の発見の可能性が前臨床カンジダの数の増加によって改善することができます調節生物学/生化学的特性を表示するTES。したがって、表現型スクリーニングのために適合新しいHTSアッセイの開発は、新薬のヒットの発見のために重要な薬理学的なツールを提供する可能性を提供することができます。 ^{3、4、5、6は}また、HTSは、現在によるカスタム設計された柔軟なロボットのインストール、新規読み出し技術と豊富な小型化などの近年の重要な技術の変換に速いペースで行うことができます。表現型スクリーニング（別名前方薬理学）の使用への関心の高まりに貢献する因子のうち^{2、 図7は、}分子標的（ターゲットベースのスクリーニング/生化学反応）に関する機能的効果ではなく、単純化還元主義の前提に焦点を当てることより可能性があるという認識であります笙へワット臨床効果。このように、表現型スクリーニングは、新しい潜在的な治療化合物と、現在治療不可能な疾患の分子経路を明らかにする可能性を秘めています。 ²

適切に与えられた分子標的または細胞の機能のための阻害剤または活性化因子を同定するために、高感度で信頼性のアッセイは、 善意のヒットと偽陽性を区別するために必要とされます。だから、何が良いアッセイを作りますか？所与のアッセイの品質は最初の（Z因子を介して反射された）信号対雑音比によって判断されなければなりません。 ⁸第二に、ターゲットを絞った効果や画面の目標は明確に確立されるべきです。具体的には、リガンド – 受容体結合を評価するために設計されたアッセイとは対照的に、例えば、機能的細胞ベースのアプローチは、受容体のスクリーニングのための重要な利点を提供することができます。この理由は、後者のアプローチは、アゴニストおよびアンタゴニストリガンドを区別することはできませんということです。SS =「外部参照」とは対照的に>図9は、細胞ベースのアプローチは、受容体機能を直接生物学的表現型を評価することができるように、より効果的である可能性が高い（増殖、細胞周期停止、アポトーシス、および/または分化）。しかし、彼らが特定の細胞内標的を侵害するような生化学的アッセイは、表現型アッセイよりも有意な利点を提供することができることに留意しなければなりません。その後、アクションの薬剤分子機構に関連する調査を簡略化しながら十分に最適化生化学的アッセイは、一般的に表現型スクリーニング未満のデータの散布を持つことになります。しかし、ターゲットベースまたは生化学アッセイの主な欠点は、生物学的システム（もともと生化学アッセイにおいて研究特異性の喪失）で試験した場合、非特異的な標的に影響を与える可能性があり、偽陽性ヒットの速度を増幅する可能性があります。 ¹⁰負と正のヒットの間で十分に確立されたカットオフポイントは、偽陽性の数を最小限に抑えることができますが、私nは一次スクリーニングは、無傷の細胞、全組織または動物全体としてネイティブの細胞環境を模倣する生理学的に関連するシステムの使用は、アッセイデザイン振り子のコアのまま。したがって、表現型スクリーニングは、化合物の活性または作用様式の予備知識がなくても、無識別された薬剤標的を伴う疾患のために望ましい/生物学的表現型効果を持つ鉛の発見を可能にします。 ¹¹

市販のマウスモデルおよび化学化合物のクラスタ化されたサブファミリ：本明細書中での研究は、2つの重要なコンポーネントに基づいて最適化され、再現性の表現型スクリーニングの開発とテストに関するものです。動物モデルに関しては、アッセイは、 緑色蛍光タンパク質 （GFP）の発現は第によって駆動されるマウス系統（Nur77 ^GFP）カセットを含む細菌人工染色体を保有由来するリンパ球の使用に依存します電子Nur77プロモーター。 ¹²この刺激の特徴は、Nur77は、T細胞受容体（TCR）またはB細胞受容体（BCR）刺激後にアップレギュレート前初期遺伝子であるという事実に基づいています。スクリーニング方法自体については^{、図12に示すように} 、アプローチは、大規模な化学ライブラリー（> 10 ⁵の化合物）を評価するために必要な時間を最小限に抑えながら、些細な類似体のスクリーニングを回避するのを助けるために使用しました。そうするために、バーチャルスクリーニングツールを使用して、医薬化学者によって選択された化合物のデータベースを参考として知られている活性種の構造を使用して位相的に類似する化合物を同定するために利用されました。このアプローチは、私たちは136,000を超える化学物質の総合的なライブラリを表す4398化合物をスクリーニングすることができました。