A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

criblage à haut débit (HTS) est une stratégie éprouvée largement adoptée pour l'identification de nouvelles molécules thérapeutiques ou pour le repositionnement de médicaments approuvés par la FDA dans de nouvelles indications médicales. ¹ Jusqu'à présent, le succès HTS obtenu peut être mesurée par la pléthore de médicaments précédemment découverts. Par exemple, l'inhibiteur de tyrosine-kinase lapatinib utilisé pour le traitement du cancer du sein, la sitagliptine; une dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4), l'inhibiteur utilisé comme un médicament anti-hyperglycémique, et la Bcr-Abl inhibiteur de tyrosine kinase dasatinib oral pour le traitement de la leucémie myéloïde chronique représentent quelques exemples d'une liste de médicaments approuvés initialement découverts par HTS. ² Bien que la productivité de l'industrie pharmaceutique a récemment souffert d'un manque dans la découverte de nouvelles entités chimiques, la probabilité de découverte de médicaments réussie peut être améliorée grâce à une augmentation du nombre de candida pré-cliniquetes présentant des propriétés biologiques / biochimiques modulateurs. En conséquence, le développement de nouveaux tests HTS adaptés pour le criblage phénotypique pourrait offrir le potentiel de fournir des outils pharmacologiques importants pour la découverte de nouveaux hits de drogue. ^{3, 4, 5, 6} En outre, HTS peuvent maintenant être effectuées à un rythme plus rapide en raison de transformations technologiques importantes au cours des dernières années , y compris les installations sur mesure flexibles robotiques, de nouvelles technologies de lecture et une miniaturisation poussée. ^{2, 7} Parmi les facteurs qui contribuent à l'intérêt croissant pour l'utilisation du dépistage phénotypique (aka l' avant de la pharmacologie) est la perception qu'en se concentrant sur les effets fonctionnels plutôt que des hypothèses réductionnistes simplificatrices concernant les cibles moléculaires (dépistage / réactions biochimiques par objectifs) est plus probable sho efficacité clinique w. Ainsi, le dépistage phénotypique tient la promesse de découvrir de nouveaux composés potentiellement thérapeutiques et les voies moléculaires des maladies actuellement incurables. ²

Pour bien identifier des inhibiteurs ou activateurs pour une cible moléculaire donnée ou la fonction cellulaire, un dosage très sensible et fiable est nécessaire pour faire la différence entre succès de bonne foi et de faux positifs. Donc, ce qui fait un bon dosage? La qualité d'un dosage donné doit être jugé par le premier rapport signal-sur-bruit (par un facteur réfléchi Z). ⁸ Deuxièmement, l'effet ciblé ou le but de l'écran doivent être clairement établies. Par exemple, les approches basées sur les cellules fonctionnelles peuvent offrir des avantages significatifs pour le dépistage du récepteur par rapport à un essai spécialement conçu pour évaluer la liaison du ligand-récepteur. La raison pour cela est que cette dernière approche ne peut pas différencier entre les ligands agonistes et antagonistes.ss = "référence externe"> 9 En revanche, une approche basée sur des cellules est susceptible d'être plus efficace que la fonction du récepteur peut être évalué directement en un phénotype biologique (prolifération, arrêt du cycle cellulaire, l' apoptose et / ou la différenciation). Cependant, il faut noter que les tests biochimiques peuvent fournir des avantages significatifs par rapport aux essais phénotypiques car ils empiètent sur une cible intracellulaire spécifique. Un dosage biochimique bien optimisé aura généralement moins de dispersion de données qu'un dépistage phénotypique tout en simplifiant la suite des enquêtes relatives au mécanisme moléculaire de la drogue de l'action. Cependant, l'inconvénient majeur de tests d'objectifs ou biochimiques est le risque d'amplifier le taux de résultats faussement positifs qui peuvent influer sur les cibles non spécifiques lorsqu'il est testé dans un système biologique (perte de la spécificité étudiée à l'origine dans le dosage biochimique). ¹⁰ Bien que d' un point de coupure bien établie entre résultats négatifs et positifs peut réduire le nombre de faux positifs in le criblage primaire, l'utilisation d'un système physiologiquement pertinent mimant l'environnement cellulaire natif telles que des cellules intactes, des tissus entiers ou animal entier reste le noyau du pendule de la conception de l'essai. Par conséquent, le dépistage phénotypique permet la découverte de plomb avec des effets phénotypiques biologiques / souhaitables pour les maladies sans cibles de médicaments identifiés sans avoir une connaissance préalable de l'activité du composé ou le mode d'action. ¹¹

L'étude de ce document concerne le développement et le test d'un dépistage phénotypique optimisé et reproductible sur la base de deux éléments importants: un modèle de souris disponible dans le commerce et une sous-famille cluster de composés chimiques. En ce qui concerne le modèle animal, le test repose sur l'utilisation de lymphocytes provenant d'une souche de souris (Nur77 ^GFP) hébergeant un chromosome artificiel bactérien contenant une cassette dans laquelle l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP) est entraîné par epromoteur e Nur77. ¹² La caractéristique de cette stimulation est basée sur le fait que Nur77 est un gène précoce immédiat régulée à la hausse suivant récepteur des lymphocytes T (TCR) ou un récepteur de lymphocyte B (BCR) de stimulation. ¹² En ce qui concerne la méthode de dépistage lui – même, une approche a été utilisée pour aider à éviter la projection d'analogues triviales tout en minimisant le temps nécessaire pour évaluer une grande bibliothèque chimique (> 10 ⁵ composés). Pour ce faire, une base de données de composés chimiques sélectionnés par les chimistes médicinaux en utilisant des outils de criblage virtuel a été exploitée pour identifier des composés topologiquement similaires en utilisant des structures de semences actives connues comme des références. Cette approche nous a permis de cribler 4,398 composés représentant une bibliothèque globale de plus de 136.000 entités chimiques.