ライブ共焦点イメージングは、開発を研究するための強力なツールと生物学者を提供します。ここでは、 シロイヌナズナの花の開発のライブ共焦点イメージングのための詳細なプロトコルを提示します。
植物の成長と発展の研究は長い間死んで、固定組織を使用して、適切な細胞解像度を欠く実験技術に頼っています。数多くの蛍光体の開発と組み合わせた共焦点顕微鏡の最近の進歩は、これらの問題を克服し、ライブのサンプルで、良い細胞の解像度で、同時にいくつかの遺伝子の発現を研究する可能性を開きました。ライブ共焦点イメージングは、開発を研究するための強力なツールで植物生物学者を提供し、広く根の成長と茎頂分裂組織の側面に横方向の臓器の形成を研究するために使用されてきました。しかし、それは広くにより、このような花の分裂組織と共に成長がく片などの花を、イメージングに固有の課題に一部、花の開発の研究に適用され、そして下の組織からの蛍光をフィルタリングされていません。ここでは、アラブの開発、ライブでライブ共焦点イメージングを実行するための詳細なプロトコルを提示します直立または倒立顕微鏡のいずれかを使用して、花芽をidopsis。
または、頂端分裂組織 – – 芽や根の植物体の大部分は、ステム・チップで、または近くに位置する細胞のグループからポスト胎生形成しています。大人の植物のすべての地上構造物は、継続的にその側面に横方向の臓器を作り出す茎頂分裂組織(SAM)、から派生:栄養段階の間、葉、花の分裂組織(FMS)、それは生殖相に遷移した後。順番にFMSが花へと発展します。シロイヌナズナSAMは、一度に横臓器いずれかを生成しながら、繰り返し、螺旋パターンで、FMSが同時に解明複数発達プログラムと、部分的に同期して4つの渦巻き内の花器官の4種類の生成します。異なった花器官のアイデンティティの仕様の基礎となる遺伝子ネットワークは、部分的に花のdevelopmeのが、多くの側面(レビューのために、参考文献1、2を参照)が解読されていますNT、花器官の位置と渦巻きの間の境界の定義など、よくわかっていないまま。
植物の開発の初期の分子遺伝学的研究は、主に遺伝子発現を解析するために、このようなin situハイブリダイゼーションおよびGUSの記者のように 、技術に依存していました。これらのメソッドは、豊富な情報を提供し、大幅に植物の成長と花の開発の我々の理解に貢献してきたが、重要な制限があります:彼らは良い携帯解像度が不足している、同じ内の複数の遺伝子の発現パターンを簡単に観察することができません。サンプルは、そして重要なのは、唯一の死者、固定組織に適用することができます。共焦点顕微鏡の最近の進歩は、これらの制限を克服し、植物の形態形成の基礎をなす過程を調査するための強力なツールと発達生物学者を提供しています。具体的には、共焦点顕微鏡は、Cであり、それらの形成、全体生組織および器官の観察を可能にします完全な開発などの典型動的なプロセスを理解することがritical。
ライブ共焦点イメージングは広く、( 例えば参考文献7、8( 例えば 、3参照4、5、6)が、いくつかの報告を除き、SAMによる植物の空中成長と横方向の臓器の生産を分析するために使用されてきました9、10)、それが広く花の開発の研究に適用されていません。 SAMのライブ共焦点イメージングのためのプロトコルは(11、12を参照するなど )が利用可能であり、どのようにイメージSAMを囲む開発花芽をするための優れた基盤を提供します。しかし、イメージング花芽具体的な課題を提示します。例えば、花芽を迅速SAMよりも大きくなり、ステージ4で、萼片は、(参照13に記載のように段階)FMを覆う起動し、下にある組織( 図2A)からの蛍光を調光。ここでは、直立または倒立顕微鏡と水浸漬レンズのいずれかを使用して、シロイヌナズナの花のつぼみの開発にライブ共焦点イメージングを実行する方法を説明する詳細なプロトコルを提供します。我々は以前、参照14で、このプロトコルを発表しました。
ここでは、共焦点顕微鏡と水浸漬レンズをシロイヌナズナ花芽を開発し、ライブの画像化のためのプロトコルを提供します。これが直立または倒立顕微鏡のいずれかで行うことができますが、元を使用するように簡単かつ迅速です。異なる共焦点システムは、速度、感度、および波長を分離する能力の点で有意に異なることも注目に値します。同じサンプルで、最高の共焦点顕微鏡は現在、画像、いくつかの異なるチャネル( 図2G 例えば GFP、YFP、DsRedのヨウ化プロピジウム)を可能にします。いくつかの共焦点顕微鏡は、同時に複数のフルオロフォアからの蛍光を収集し、その後それらを分離することができ、スペクトル検出器が装備されています。定期的な検出器を使用する場合は、しかし、レーザーやフィルタのセットが異なる蛍光体からの蛍光を励起し、分離するために使用する必要があります。いくつかのフルオロフォア( 例えば 、CFP ANを完全に明確な発光スペクトルを有しますYFP)D、及び同時に画像化することができます。他のフルオロフォアは、部分的に重複する発光スペクトル( 例えば、GFPおよびYFP)を有し、そして通常撮像時間を増加させる、別々に画像化される必要があります。近くに蛍光団を画像化することもしばしば他のチャンネルへの漏洩から1発蛍光団からの蛍光を防ぐために、各チャンネルのために収集され、どのくらいスペクトルの制限が必要です。これは、レーザパワーと利得の増加によって補償することができる収集された信号の強度の損失を引き起こします。しかし、長期の撮影時間と増加レーザパワーは漂白剤及び/又は試料に損傷を与えることができます。増加したレーザパワー及び/またはゲインもバックグラウンドノイズを増加させることができます。各サンプルの信号強度、解像度、撮像時間の最適化は、試行錯誤のプロセスを介して行われ、永久的なトレードオフを伴います。
このプロトコルは、解剖茎頂の側面で開発花芽のライブ共焦点イメージングを実行する方法について説明します。それ茎頂は、植物の残りの部分に接続されていないとサイトカイニンを含む培地中で成長しているという事実は、SAMと花の発達に影響を与える可能性があると主張することができます。しかし、この媒体は解剖茎頂分裂組織が正常なplastochronで新しい花芽を生成し、これらの花芽は、通常15を開発することを保証するために、試行錯誤のプロセスを通じて経験的に設計されました。同様に、がく解剖は、遺伝子発現パターンや花の残りの発展に影響を与えるように表示されません。 SAMのライブ共焦点イメージングを実行するためにどのように他のプロトコルの詳細は、まだ植物( 例えば 、参照11)の残りの部分に取り付けられています。そのようなプロトコルはするように適合され、及び特にサイトカイニン関連のプロセスを研究するとき、花の開発のイメージングのために有用な選択肢を提供することができます。しかし彼らはいくつかの欠点が存在する:幹伸長やねじれをし、花芽の向きを変えます。 A植物の残りの部分に結合して茎頂を画像化することは正立顕微鏡でうまく動作しながら、ND、それは倒立顕微鏡でこれを行うにはるかに複雑です。
液浸レンズは、「乾燥」レンズ(空気によってサンプルから分離されている、すなわちレンズ)よりも良好な開口数(NA)を有し、したがって、共焦点顕微鏡を使用する場合に重要である試料のより微細な分解能を提供します。イメージングプロセスの間脱水から茎頂を防止しつつ、水浸漬レンズを使用すること、したがって、ドライレンズよりもはるかに良いNAを提供します。グリセリンと油レンズは水のレンズよりもさらに高いNAを持っているが、それらはサンプルもタイムラプス実験の間に成長し続けて茎頂、の大きさに非常に実用的でないカバースリップの使用を必要としています。サンプルの大きさを考えると、長い作動距離を有するレンズを使用することも重要である(花の段階に応じて、スタックが上150μmの厚さであることができます)。我々は、典型的には、1のNA及び1.7〜2.5ミリメートルの作動距離と20又は40Xレンズを使用します。
共焦点顕微鏡ソフトウェアは、三次元再構成( 図2、B1、B2およびB4)とスライスビュー( 図2、B3)を含む共焦点データを視覚化するためのいくつかの方法を、提供します。最も一般的に使用される三次元ビューは、共焦点のZスタックの最大強度投影( 図2、B1及びB4)であるが、いくつかのソフトウェア( 例えば ZENとIMARIS)ものより深い部分からの信号をフィルタリング透明度の景色を眺めることができ表皮層で発現起こるプロセス、又は遺伝子を見たときに有用であり得るサンプル( 図2、B2)。信号強度は、いずれかの画素INTEを使用して、単一の色( 図2、B1)で符号化することができますnsity、またはカラーコードを使用して( 図2、B4)。
ライブ共焦点イメージングだけでなく、花の開発に貴重な定性的な洞察を提供しています、それはまた、潜在的に定量的なデータの豊富な発達生物学者を提供します。異なるソフトウェア( 例えば IMARIS、フィジー、MARS-ALT、MorphographX 15、20、21)の数、または1つまたはいくつかのレポーター、または異なる細胞におけるレポーターの発現レベルを発現する細胞の量の定量化を可能にします。そのようなソフトウェアはまた、自動細胞分割を行う細胞系統を追跡し、成長を定量化するために使用することができます。この別のソフトウェアには、同様のツールを提供していますが、また、多くの点で異なります。 MARS-ALTとMorphoGraphXはIMARISのAとは異なり、植物15、20、21のために特別に設計されましたNDフィジー。 IMARISおよびMARS-ALTは、サンプル全体のセグメント化および分析を可能にしながらMorphoGraphXのみ、表皮層のセグメント化および分析を可能にします。ただし、MARS-ALTは、3つの異なる角度15からの同じサンプルの前イメージングを必要とし、IMARISは単一のスタックを必要とします。定量的な情報へのアクセスは、花の開発の我々の理解を促進することが重要です。
The authors have nothing to disclose.
著者は彼のサポートのための教授エリオット・M・マイヤーウィッツ感謝したい、として技術的な問題の解決に彼らの助けのためのカリフォルニア工科大学の生物学的イメージング施設で、ダートマス大学博士とアンドレス・コラゾで原稿上のコメントと同様に、アン・ラバンウェイライブ共焦点イメージング。ナタナエル・プルネットの仕事は、エリオット・M・マイヤーウィッツにグラントR01 GM104244を通じて米国国立衛生研究所によってサポートされています。
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |