חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס
Summary
הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.
Abstract
המחקר של גידול צמחים ופיתוח הסתמך ארוך על טכניקות ניסוי באמצעות מתות, רקמות קבועות וחסרות ברזולוציה הסלולר נכונה. התקדמות מיקרוסקופיה confocal, בשילוב עם הפיתוח של fluorophores הרב, יש להתגבר על בעיות אלה ופתחה את האפשרות ללמוד את הביטוי של גנים אחדים בעת ובעונה אחת, עם רזולוצית הסלולר טובה, בדגימות לחיות. הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים צמח עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח, וכן נעשה שימוש נרחב ללמוד צמיחה שורש היווצרות של איברים לרוחב על צלעותיה של meristem לירות הפסגה. עם זאת, זה לא יושם באופן נרחב לחקר התפתחות פרח, בין שאר בשל לאתגרים ייחודיים הדמית פרחים, כמו עליי גביע גדלים מעל meristem פרח, ולסנן את הקרינה מן הרקמות בסיסיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה confocal לחיות על חיים, פיתוח הערביניצני פרחי idopsis, או באמצעות זקופה או מיקרוסקופ הפוכה.
Introduction
רוב בגוף הצמח יוצר פוסט-בעוברים מקבוצות של תאי גזע הנמצאים ליד או הקצה – או meristems פסגה – היורה והשורשים. כל המבנים מעל פני הקרקע של המפעל המבוגר נובעות meristem הפסגה לירות (SAM), אשר מייצרת איברים לרוחב ברציפות על צלעותיו: משאירה בשלב צומח meristems פרח (FMS) לאחר מעבר שלב הרבייה. FMS בתורו להתפתח פרחים. בעוד ארבידופסיס SAM מייצרת איברים לרוחב אחד בכל פעם, כמו בדגם איטרטיבי, ספירלה, FMS לייצר ארבעה סוגים של איברים פרחוניים בתוך ארבעה דורות, באופן סינכרוני חלקית, עם תוכניות התפתחותיים מרובות נפרמות זמנית. הרשתות הגנטיות שבבסיס המפרט של זהות האורגנים הפרחוניים השונים פוענחו חלקית (לביקורות, לראות אזכור 1, 2), אך היבטים רבים של developme פרחNT, כגון מיצוב פרחוני איברים בהגדרת גבולות בין דורות, להישאר ממעטים להבין.
מחקרים גנטיים מולקולריים מוקדם של התפתחות צמח הסתמכו בעיקר על טכניקות כגון כלאה באתרו וכתבים גאס לנתח ביטוי גנים. בעוד שיטות אלה סיפקו שפע של מידע ותרם רבות להבנתנו של גידול צמחים ופיתוח פרח, יש מגבלות חשובות: הם חסרים ברזולוציה הסלולר טוב, לא מאפשרים התבוננות קלה של דפוס הביטוי של גנים מרובים באותו דגימות, וחשוב, יכולות להיות מיושמות רק רקמות מתות, קבועות. התקדמות מיקרוסקופיה confocal יש להתגבר על המגבלות האלה, ולספק ביולוגים התפתחותיים עם כלי רב עצמה כדי לחקור את התהליכים morphogenesis צמח בסיסי. בפרט, מיקרוסקופיה confocal מאפשרת תצפית של חיות רקמות ואיברים ברחבי היווצרותם, המהווה גritical כדי להבין תהליך דינמי מובהק כגון פיתוח.
הדמית confocal לחיות נעשתה שימוש נרחב כדי לנתח את הגידול האווירי של צמחים ובעלי לייצור איברים לרוחב ידי SAM (למשל שמייחס 3, 4, 5, 6), אך למעט כמה דיווחים (אזכור למשל 7, 8, 9, 10), זה לא יושם נרחב לחקר התפתחות הפרח. פרוטוקולים עבור הדמית confocal לחיות של SAM זמינים (למשל שמייחס 11, 12), ולספק בסיס טוב איך תמונת ניצני פרחים בפיתוח המקיפים את SAM. עם זאת, ניצני פרחי הדמיה מציב אתגרים ספציפיים: למשל,ניצני פרחים במהירות להיות גדול יותר SAM, ובשלב 4, עלי גביע להתחיל כיסוי FM (שלבים כמתואר התייחסות 13), ואת עמעום הקרינה מן היסוד רקמות (איור 2 א). כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המסביר כיצד לבצע הדמית confocal לחיות בפיתוח ניצני פרחים ארבידופסיס או באמצעות זקופה או מיקרוסקופ הפוך עדשת מי טבילה. אנחנו קודם לכן פרסמנו פרוטוקול זה ביחס 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול עבור ההדמיה של חיה, ניצני פרחים ארבידופסיס מתפתחים עם מיקרוסקופ confocal עדשה-טבילה במים. אמנם זה יכול להיעשות גם עם זקופה או מיקרוסקופ הפוכה, זה קל ומהיר להשתמש לשעבר. כמו כן ראוי לציין כי מערכות confocal שונות להשתנות באופן משמעותי במונחים של מהירות, רגישות, ואת היכולת להפריד אורכי גל. מיקרוסקופי confocal הטובים כעת לאפשר לערוצים שונים תמונה מספר (למשל GFP, YFP, dsRed ו יודיד propidium; 2G האיור) באותו דגימות. מיקרוסקופים confocal חלקם מצוידים בגלאי רפאים, אשר יכולים לאסוף את הקרינה מכמה fluorophores זמנית ולהפריד אותם לאחר מכן. בעת שימוש בגלאי רגיל, לעומת זאת, קבוצה של לייזרים ומסננים יש להשתמש כדי להלהיב ולהפריד את הקרינה מן fluorophores השונה. Fluorophores לחלקם יש ספקטרום פליטה ברור לחלוטין (בלתי CFP למשלד YFP), ויכול להיות צלם בו זמנית. Fluorophores האחר יש ספקטרום פליטה חופף חלקית (GFP למשל ו YFP), ובדרך כלל צריך להיות צלם בנפרד, אשר מגדיל את זמן הדמיה. הדמית fluorophores הקרובה גם לעתים קרובות דורשת הגבלה כמה הקשת נאספת עבור כל ערוץ למנוע קרינה מן fluorophore אחד מ דולף לתוך ערוץ אחר. זו גורמת לאובדן של עוצמת האות שנאספו, אשר יכול להיות מפוצה על ידי עלייה כוח לייזר ורווח. עם זאת, זמן הדמיה ממושכת וכוח לייזר מוגבר עלול להלבין ו / או נזק המדגם. כוח הליזר מוגבר ו / או רווח עשוי גם להגביר את רעשי רקע. אופטימיזציה של עוצמת אות, רזולוציה וזמן הדמיה עבור כל דגימה נעשתה באמצעות תהליך של ניסוי וטעייה, והיא כרוכה בפשרות קבעו.
פרוטוקול זה מסביר כיצד לבצע הדמיה confocal לחיות ניצני פרחים לפתח על צלעותיה של איפקס לירות גזור. זהניתן לטעון כי העובדה איפקס לירות אינה מחוברת לשאר הצמח גדלה במצע המכיל Cytokinins עלול להשפיע SAM ופיתוח פרח. עם זאת, המדיום הזה תוכנן באופן אמפירי באמצעות תהליך של ניסוי וטעייה כדי להבטיח צילומים הגזורים meristems הפסגה לייצר ניצני פרחים חדשים על פלסטוכרון הנורמלי, וכי ניצני פרחים אלה להתפתח בצורה תקינה 15. באופן דומה, דיסקציה עָלֶה גָבִיעַ אינה מופיעה להשפיע דפוסי ביטוי גנים או ההתפתחות של שאר הפרחים. פרוטוקולים אחרים בפירוט כיצד לבצע הדמיה confocal לחיות של SAM עדיין מחוברת לשאר הצמח (למשל הפניה 11). פרוטוקולים כזה יכול להתאים, ולהציע אלטרנטיבה שימושית עבור ההדמיה של פיתוח פרחים, במיוחד כאשר לומד תהליכים הקשורים לציטוקינין. הם מציגים כמה חסרונות עם זאת: מתארך הגבעול ומסובב, ומשנה את הכיוון של ניצני פרחים; אnd תוך הדמיה איפקס לירות מצורפת לשאר המפעל עובד היטב עם מיקרוסקופ זקוף, זה הרבה יותר מסובך לעשות זאת עם מיקרוסקופ הפוכה.
עדשות Immersion יש צמצם מספרי טוב (NA) מאשר עדשות "יבשות" (עדשות כלומר המופרדים מן המדגם על ידי אוויר), ולכן מספקות רזולוציה עדינה של המדגם, שהוא קריטי כאשר באמצעות מיקרוסקופ confocal. באמצעות עדשת מי טבילה ובכך מספק NA הרבה יותר טוב מאשר עדשה יבשה, תוך מניעת איפקס לירות מן להתייבשות במהלך תהליך ההדמיה. בעוד גליצרין ועדשות שמן יש NA אפילו גבוה יותר מאשר עדשות מים, הם דורשים את השימוש coverslip, וזה מאוד חסר מעשיות עם מדגם בגודל של איפקס לירות, אשר גם ממשיך לגדול במהלך ניסויים זמן לשגות. בהתחשב בגודל של הדגימות (תלוי בשלבים הפרחוניים, ערימות יכולות להיות מעל 150 מיקרומטר עבה), חשוב גם להשתמש בעדשה עם מרחק עבודה ארוך. אנחנו בדרך כלל להשתמש בעדשה 20 או 40X עם NA של 1 ו מרחק עבודה של 1.7-2.5 מ"מ.
תוכנת מיקרוסקופ Confocal מציעה מספר דרכים כדי להמחיש נתונים confocal, כולל שחזורים תלת-ממדיים (איור 2, B1, B2 ו- B4) ונוף פרוסה (איור 2, B3). בעוד תצוגות תלת מימדי הנפוץ ביותר הן תחזיות בעוצמה מקסימלית של Z- ערימות confocal (איור 2, B1 ו- B4), תוכנה כלשהי (למשל זן Imaris) מציעים גם נוף שקיפות שמסננת את האות מ בחלקים עמוקים יותר של המדגם (איור 2, B2), אשר יכול להיות שימושי כאשר מסתכלים תהליכים המתרחשים, או הגנים מתבטאת, שכבת אפידרמיס. עוצמת האות יכול להיות מקודד או עם צבע אחד (איור 2, B1), באמצעות פיקסל intensity, או באמצעות קוד צבע (איור 2, B4).
הדמית confocal לחיות לא רק מציעה תובנה איכותיות רבות ערך על פיתוח פרח, זה גם מספק לביולוגים התפתחותי פוטנציאלי עם שפע של נתונים כמותיים. תוכנות שונות (למשל Imaris, פיג'י, MARS-ALT, 15 MorphographX, 20, 21) מאפשרת כימות של מספר או נפח של תאים המבטאים אחד או כמה עיתונאים, או את רמת הביטוי של עיתונאי בתאים שונים. תוכנה כזו יכולה לשמש גם כדי לבצע פילוח תא אוטומטי, לעקוב אחר שושלות תאים ולכמת צמיחה. תוכנות שונות זו מציעות כלים דומים, אך גם שונות במובנים רבים. MARS-ALT ו- MorphoGraphX תוכננו במיוחד עבור צמחים 15, 20, 21, שבניגוד Imarisnd בפיג'י. MorphoGraphX מאפשר רק עבור פילוח וניתוח של שכבת אפידרמיס, בעוד Imaris ומאדים-ALT לאפשר פילוח וניתוח של המדגם כולו. עם זאת, MARS-ALT דורש הדמיה לפני מאותו מדגם משלוש זוויות שונות 15, ו Imaris רק דורש בערימה אחת. גישה למידע כמותי הוא קריטי כדי לקדם את ההבנה של התפתחות הפרח שלנו.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר מבקש להודות לפרופ 'אליוט מ Meyerowitz על תמיכתו, ואת הערות על כתב היד, וכן באן Lavanway ב Dartmouth College וד"ר אנדרס קולזו במתקן הדמיה ביולוגית בקלטק עזרתם בפתרון בעיות טכניות עם הדמית confocal לחיות. עבודתו של נתנאל Prunet נתמך על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות באמצעות גרנט R01 GM104244 כדי אליוט מ Meyerowitz.
Materials
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
Riferimenti
- Prunet, N., Jack, T. P. Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs. Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).
- Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development. FEBS J. , (2016).
- Heisler, M. G., et al. Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).
- Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex. Science. 310 (5748), 663-667 (2005).
- Yadav, R. K., et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).
- Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima. Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).
- Urbanus, S. L., et al. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 9, (2009).
- Hong, L., et al. Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging. Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).
- Roeder, A. H., et al. Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem. Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Dev. Biol. , (2016).
- Fernandez, R., et al. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. , (2010).
- Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).
- Irish, V. F., Sussex, I. M. Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).
- Vernoux, T., et al. The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX. Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).
