现场共聚焦成像提供生物学家提供了强大的工具来研究开发。在这里,我们提出了一个详细的协议制定拟南芥花的活共焦成像。
植物生长发育的研究长期依赖于使用死,固定的组织,缺乏适当的细胞高分辨率的实验技术。在激光共聚焦显微镜的最新进展,与众多荧光团的发展相结合,克服了这些问题,并打开的可能性,同时学习几种基因的表达,具有良好的细胞高分辨率,活样本英寸现场共聚焦成像提供植物生物学家提供了强大的工具来研究开发,并已被广泛用于研究根系的生长和侧生器官对茎尖分生组织的侧翼形成。然而,它并没有被广泛地应用到花发育的研究,部分原因是由于特定于成像花卉,如生长在花分生组织的萼片,和下面的组织筛选出荧光挑战。在这里,我们提出了一个详细的协议对现场进行直播共焦成像,阿拉伯发展idopsis花芽,即使用竖直或倒置显微镜。
大多数植物体的形成后embryonically从位于或接近尖端干细胞的群体 – 或者顶端分生组织 – 芽和根的。所有植株的地上结构派生从茎尖分生组织(SAM),它连续地产生在其侧面侧生器官:在营养生长期的叶,花分生组织(FMS),它转变到生殖阶段之后。反过来外长发育成花朵。虽然拟南芥SAM产生侧生器官一次一个,以迭代的,螺旋形图案,FMS产生内的四个轮生四种类型的花器官,以部分同步的方式,与多个发育程序同时解开。不同的花器官身份的规范基础的遗传网络已经部分破译(综述见参考文献1,2)花DEVELOPME的,但很多方面个nt,诸如花器官定位和边界的旋涡之间的定义,仍然知之甚少。
植物发育早期的分子遗传学研究主要依赖于技术,如原位杂交和GUS记者分析基因表达。虽然这些方法都提供了丰富的信息,并极大地促进了我们的植物生长和花卉发展的理解,也有很大的局限性:他们缺乏良好的细胞高分辨率,不允许在同一个易于观察多个基因的表达模式样本,并且重要的是,可以仅适用于死的,固定的组织。在激光共聚焦显微镜的最新进展已克服这些限制,并提供发育生物学家提供了强大的工具来研究这个过程潜在的植物形态。特别是,共聚焦显微镜允许在他们的生活形成组织和器官的观察,这为critical全面理解一个典型的动态过程,如发展。
活共焦成像已被广泛用于分析由SAM植物的地上生长和生产横向器官( 例如参照图3,4,5,6),但与的少数报道的例外( 例如参考文献7,8, 9,10),它并没有被广泛地应用到花发育的研究。对于SAM的活共焦成像协议可( 如参考11,12),并提供如何图像显影花蕾周围的SAM了良好的基础。然而,成像花蕾提出具体的挑战:例如,花芽很快变得比SAM更大,和在阶段4,萼片开始覆盖FM(阶段如参考文献13所述),和调光从下面的组织( 图2A)的荧光。在这里,我们提供详细的协议说明了如何使用任一垂直或倒置显微镜和水浸渍透镜显影拟南芥花芽执行实时共焦成像。我们以前出版的参考14此协议。
在这里,我们提供了一种活的发育拟南芥花蕾用共聚焦显微镜和浸水镜头成像的协议。虽然这可与竖直或倒置显微镜来完成,它是更容易和更快地使用前者。还值得一提的是,不同的共焦系统中的速度,灵敏度和能力来分离波长方面显著变化。最好的共聚焦显微镜现在允许图像几个不同的信道( 例如 GFP,YFP,DsRed的和碘化丙啶; 图2G)的相同样品英寸一些共焦显微镜配备了光谱检测器,其可以从几个荧光团同时收集的荧光,并将其随后分离。当使用常规的检测器,但是,一组激光器和滤波器必须用于激发和荧光从不同的荧光团分离。一些荧光基团具有完全不同的发射光谱( 例如 CFP的ðYFP),并且可以同时进行成像。其它的荧光团具有部分重叠的发射光谱( 例如 GFP和YFP),并且通常需要单独成像,这增加了摄影时间。成像接近的荧光团还常常需要限制多少光谱的收集对于每个信道,以防止荧光从一个荧光团泄漏到另一信道。这使得采集到的信号,这可以通过增加激光功率和增益进行补偿的强度的损失。然而,延长成像时间和增加的激光功率可进行漂白和/或损坏样品。增加激光功率和/或增益也可能增加背景噪声。信号强度,分辨率和成像时间为每个样品的优化是通过试验和错误的过程中完成的,并涉及永久权衡。
该协议说明了如何执行花蕾上解剖茎尖的侧面开发的现场聚焦成像。它可以说,该茎尖没有连接到工厂的其余部分,事实上生长在含细胞分裂素可能影响SAM和花卉发展的媒介。然而,该介质通过试错的过程凭经验设计,保证了拍摄解剖顶端分生组织的正常plastochron产生新的花蕾,而这些花蕾一般在15发展。同样,萼片解剖似乎并不影响基因表达模式或花的其余部分的发展。其它协议的细节如何执行SAM的活共焦成像仍连接到设备的其余部分( 例如,参考文献11)。这样的协议可以适于,并提供用于开发花,特别是研究细胞分裂素相关的处理时的成像有用的替代方案。他们提出几个缺点但是:茎伸长和曲折,并改变花芽的方向;一个第二成像时附着在植物的其他部分茎尖与正置显微镜工作得很好,它是更为复杂倒置显微镜这样做。
浸没透镜具有更好的数值孔径(NA)比“干”透镜(即从样品通过空气中分离即透镜),并因此提供所述样品,使用共焦显微镜时,这是关键的更精细的分辨率。使用水浸渍透镜因此提供了更好的NA比干透镜,同时防止茎尖从在成像过程期间脱水。虽然甘油和石油镜头具有更高的NA比水的镜头,它们需要使用盖玻片,这是非常不现实的一个样本茎尖,这也使在时间推移实验的规模日益扩大的。给定样品的大小(取决于花香阶段,栈可以是超过150微米厚),它也是重要的是使用一个透镜具有长的工作距离。我们通常使用20或40X透镜为1的NA和1.7-2.5毫米的工作距离。
共焦显微镜的软件提供了几种方法来可视化共聚焦数据,包括三维重建( 图2,B1,B2和B4)和切片视图( 图2,B3)。虽然最常用的三维视图是共焦Z-栈( 图2,B1和B4),一些软件的最大强度投影( 例如 ZEN和了Imaris)还提供透明性的观点,从较深的部位滤除信号样本( 图2,B2),看着,表皮层表示发生过程的基因,或当它可以是有用的。信号强度既可以用单一颜色( 图2,B1)进行编码,使用像素INTEnsity,或者使用彩色码( 图2,B4)。
现场共聚焦成像,不仅提供了宝贵的定性的见解花发育,还可能提供发育生物学家提供了丰富的定量数据。不同的软件( 例如了Imaris,斐济,MARS-ALT,MorphographX 15,20,21)允许数或表达一个或几个记者,或在不同细胞中的报道基因的表达水平的细胞的体积的定量。这样的软件也可用于执行自动细胞分割,跟踪细胞谱系和量化的增长。这种不同的软件提供类似的工具,但也不同于在许多方面。 MARS-ALT和MorphoGraphX被植物15,20,21而设计的,不象一了Imaris第二斐济。 MorphoGraphX仅允许表皮层的分割和分析,而以及了Imaris MARS-ALT允许整个样品的分割和分析。然而,MARS-ALT需要相同的样品的从三个不同的角度15的现有成像和了Imaris只需要一个单一的叠层。获得定量信息是我们进一步发展花卉的理解是至关重要的。
The authors have nothing to disclose.
笔者要感谢埃利奥特教授M.迈耶罗维茨对他的支持,以及对稿件达特茅斯学院和安德烈什·科拉佐博士在加州理工学院生物成像设备对他们的帮助解决的技术问题的意见,以及安·拉万韦现场共聚焦成像。纳森尔·普鲁内的工作由卫生部通过格兰特R01 GM104244埃利奥特M.迈耶罗维茨美国国家研究院的支持。
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |