imagem confocal ao vivo fornece biólogos com uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a imagem confocal ao vivo de desenvolver flores Arabidopsis.
O estudo do crescimento e desenvolvimento das plantas foi confiado por muito tempo em técnicas experimentais utilizando, tecidos fixados mortas e sem resolução celular adequada. Recentes avanços em microscopia confocal, combinados com o desenvolvimento de vários fluoróforos, têm superar esses problemas e abriu a possibilidade de estudar a expressão de vários genes simultaneamente, com uma boa resolução celular, em amostras vivas. imagem confocal ao vivo fornece biólogos de plantas com uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento, e tem sido amplamente utilizada para estudar o crescimento das raízes ea formação de órgãos laterais nos flancos do meristema apical atirar. No entanto, ele não tem sido amplamente aplicada ao estudo de desenvolvimento da flor, em parte devido aos desafios que são específicos para imagiologia flores, como as sépalas que crescem sobre o meristema flor, e filtrar a fluorescência dos tecidos subjacentes. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para executar imagem confocal ao vivo em directo, desenvolvendo árabeidopsis botões de flores, utilizando quer uma posição vertical ou um microscópio invertido.
A maioria do corpo planta forma pós-embrionariamente de grupos de células-tronco situados na ou perto da ponta – ou meristemas apicais – dos brotos e raízes. Todas as estruturas acima do solo da planta adulta derivar a partir do meristema apical (SAM), o qual produz continuamente órgãos laterais nos flancos: folhas durante a fase vegetativa, e meristemas de flores (FMS), depois ele passa para a fase de reprodução. FMs, por sua vez desenvolver em flores. Enquanto o SAM Arabidopsis produz órgãos laterais, uma de cada vez, num padrão repetitivo, espiral, o FMS produzir quatro tipos de órgãos florais dentro de quatro espirais, de uma maneira parcialmente síncrono, com vários programas de desenvolvimento desvendar simultaneamente. As redes genéticas subjacentes à especificação da identidade dos diferentes órgãos florais foram parcialmente decifrado (para revisões, ver referências 1, 2), mas muitos aspectos da developme flornt, tal como o posicionamento dos órgãos florais e a definição de limites entre giros, permanecem pouco compreendidos.
Estudos genéticos moleculares iniciais de desenvolvimento da planta confiou na técnicas tais como hibridação in situ e repórteres de GUS para analisar a expressão do gene. Embora estes métodos têm proporcionado uma riqueza de informações e contribuíram muito para a nossa compreensão do crescimento da planta e desenvolvimento da flor, existem limitações importantes: eles não têm boa resolução celular, não permitir a fácil observação do padrão de múltiplos genes expressão na mesma amostras, e mais importante, apenas pode ser aplicado a tecidos mortos, fixos. Recentes avanços em microscopia confocal têm superar essas limitações, e fornecer os biólogos do desenvolvimento com uma ferramenta poderosa para investigar os processos de morfogênese planta subjacente. Em particular, a microscopia confocal permite a observação de tecidos vivos e órgãos ao longo da sua formação, que é critical para compreender plenamente um processo essencialmente dinâmico, como o desenvolvimento.
Imagem confocal vivo tem sido extensivamente utilizado para analisar o crescimento aéreo de plantas e a produção de órgãos laterais pelo SAM (por exemplo referências 3, 4, 5, 6), mas com a excepção de alguns relatórios (por exemplo, as referências 7, 8, 9, 10), ele não tem sido amplamente aplicada para o estudo de desenvolvimento da flor. Protocolos para imagem confocal ao vivo do SAM estão disponíveis (por exemplo, faz referência 11, 12), e fornecer uma boa base para a representação do botões florais em desenvolvimento que cercam o SAM. No entanto, botões florais de imagem apresenta desafios específicos: por exemplo,botões de flores rapidamente tornar-se maior do que o SAM, e a fase 4, sépalas começar a cobrir os (FM fases como descrito na referência 13), e escurecimento da fluorescência a partir de tecidos subjacentes (Figura 2A). Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado explicando como realizar imagem confocal ao vivo no desenvolvimento de botões florais de Arabidopsis usando uma posição vertical ou um microscópio invertido e uma lente de água-dipping. Nós publicado anteriormente este protocolo em referência 14.
Aqui, nós fornecemos um protocolo para a imagem de, em desenvolvimento de Arabidopsis botões de flores ao vivo com um microscópio confocal e uma lente de água-dipping. Enquanto isso pode ser feito com qualquer um pé ou um microscópio invertido, é mais fácil e rápido de usar o antigo. É também importante notar que diferentes sistemas confocais variar significativamente em termos de velocidade, sensibilidade, e a capacidade de separar os comprimentos de onda. Os melhores microscópios confocais agora permitir a imagem vários canais diferentes (por exemplo, GFP, YFP, dsRed e iodeto de propidio; Figura 2G) nas mesmas amostras. Alguns microscópios confocal estão equipados com um detector espectral, que pode coletar a fluorescência de diversos fluoróforos simultaneamente e separá-los depois. Ao usar um detector regular, no entanto, um conjunto de lasers e filtros devem ser usados para excitar e separar a fluorescência de fluoróforos diferentes. Alguns fluoróforos têm espectros de emissão totalmente distinta (por exemplo, um PCPd YFP), e podem ser visualizados simultaneamente. Outros fluoróforos têm espectros de emissão de sobreposição parcial (por exemplo, GFP e YFP), e geralmente têm de ser trabalhada separadamente, o que aumenta o tempo de imagiologia. Imagiologia de fluoróforos perto também muitas vezes requer a restrição quanto do espectro é recolhido para cada canal para evitar fluorescência de um fluoróforo a partir de vazando para outro canal. Isto provoca uma perda da intensidade do sinal recolhido, o que pode ser compensado por um aumento da potência do laser e ganho. No entanto, o tempo de imagiologia prolongada e aumentou a potência do laser pode branquear e / ou danificar a amostra. potência do laser aumentado e / ou ganho também pode aumentar o ruído de fundo. Otimização da intensidade do sinal, resolução e tempo de imagem para cada amostra é feito através de um processo de tentativa e erro, e envolve trade-offs permanentes.
Este protocolo explica como executar imagem confocal ao vivo de botões florais em desenvolvimento nos flancos de um ápice shoot dissecado. istoPode-se argumentar que o fato de que o ápice shoot não está ligado ao resto da planta e cresce em meio contendo citocininas podem afetar SAM e desenvolvimento da flor. No entanto, este meio foi concebido empiricamente através de um processo de tentativa e erro para garantir a atirar dissecado meristemas apicais produzir novos botões florais no plastocrono normal, e que estes botões florais desenvolver normalmente 15. Da mesma forma, dissecção sepal não parece afetar os padrões de expressão de genes ou o desenvolvimento do resto da flor. Outros protocolos detalhes como realizar imagiologia confocal vivo do SAM ainda ligado ao resto da planta (por exemplo 11 de referência). Tais protocolos poderia ser adaptada para, e oferecer uma alternativa útil para a imagem latente de desenvolver flores, especialmente quando o estudo dos processos relacionados com a citoquinina. Eles apresentam contudo várias desvantagens: os alonga-tronco e torções, e altera a orientação dos botões de flores; umand enquanto a imagem de um ápice shoot ligado ao resto da planta funciona bem com um microscópio vertical, é muito mais complicado fazê-lo com um microscópio invertido.
Lentes de imersão tem uma melhor abertura numérica (NA) do que as lentes "seco" (isto é, lentes que são separados da amostra de ar), e, por conseguinte, proporcionar uma resolução mais fina da amostra, o que é crítico quando se utiliza um microscópio confocal. Usando uma lente de água-imersão, assim, fornece uma muito melhor do que uma lente de NA seco, evitando o ápice filmagem de desidratação durante o processo de imagiologia. Enquanto glicerina e lentes de petróleo têm uma NA ainda maior do que as lentes de água, eles requerem o uso de uma lamela, que é muito pouco prático com uma amostra do tamanho de um ápice shoot, que também continua crescendo durante as experiências de lapso de tempo. Dado o tamanho das amostras (de acordo com as fases florais, pilhas pode ser superior a 150 um de espessura), que também é importante usar uma lente com uma distância de trabalho. Normalmente, utilizar uma lente de 20 ou 40X com NA de um e uma distância de trabalho de 1,7-2,5 mm.
Software microscópio confocal oferece várias formas de visualizar dados confocal, incluindo reconstruções tridimensionais (Figura 2, B1, B2 e B4) e vistas fatia (Figura 2, B3). Enquanto as vistas tridimensionais mais vulgarmente utilizados são projecções máximos de intensidade de z-pilhas confocal (Figura 2, B1 e B4), alguns de software (por exemplo, ZEN e Imaris) também proporcionam vistas de transparência que filtra o sinal a partir das partes mais profundas de a amostra (Figura 2, B2), o que pode ser útil quando se olha para processos que tomam lugar, ou genes expressos em, a camada epidérmica. A intensidade do sinal pode ser codificada com uma única cor (Figura 2, B1), utilizando pixels intensity, ou utilizando um código de cor (Figura 2, B4).
imagem confocal ao vivo não só oferece insights qualitativos valiosas sobre o desenvolvimento da flor, mas também potencialmente fornece os biólogos do desenvolvimento com uma riqueza de dados quantitativos. Software diferente (por exemplo Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permite a quantificação do número ou o volume de células que expressam um ou vários repórteres, ou o nível de expressão de um repórter em células diferentes. Esse software também pode ser usado para realizar segmentação automático de células, rastrear linhagens de células e quantificar o crescimento. Este software diferente oferece ferramentas similares, mas também difere de muitas maneiras. MARS-ALT e MorphoGraphX foram concebidos especificamente para as plantas 15, 20, 21, ao contrário de um Imarisnd Fiji. MorphoGraphX permite apenas a segmentação e análise da camada de epiderme, enquanto Imaris e MARS-ALT permitir a segmentação e análise de toda a amostra. No entanto, MARS-ALT requer a imagem antes de a mesma amostra de três ângulos diferentes 15, e Imaris requer apenas uma única pilha. O acesso à informação quantitativa é fundamental para promover nossa compreensão do desenvolvimento da flor.
The authors have nothing to disclose.
O autor gostaria de agradecer a Prof. Elliot M. Meyerowitz por seu apoio e comentários sobre o manuscrito, assim como Ann Lavanway no Dartmouth College e Dr. Andres Collazo no Facility Imagem Biológica em Caltech por sua ajuda na resolução de problemas técnicos com o imagem confocal ao vivo. O trabalho de Nathanaël Prunet é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, através Grant R01 GM104244 para Elliot M. Meyerowitz.
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |