Лабораторные весы Получение и очистка терапевтического антитела

Успех терапевтических антител продолжает стимулировать значительные инвестиции в развитие антител, как начинается волна терапии следующего поколения. Рынок антител , как ожидается, будет переработанная фрагментами антител ^1, антитело-лекарственное средство конъюгатов ^2, биспецифические антитела ³ и сконструированных антител с благоприятными свойствами ^4. Другой класс приобретает фармацевтический интерес являются биоподобий. Биоподобие антитела являются "очень похожи" реплицировать продукты терапевтического антитела, которое уже получил одобрение регулирующих органов. Предлагаемая биоподобие должна быть сравнима с отправителе антитела по отношению к его структуре, функции животных токсичности, клиническая эффективность и безопасность, человека фармакокинетики (PK), фармакодинамики (PD) и иммуногенности ^{5, 6.}

Утверждение гАтеш из биоподобных антител медленно из-за строгих ограничений на качество конечного продукта. Точные производственные процессы, такие как специфические клеточные линии и условия культивирования до финальных стадий обработки может оставаться частной собственностью. Более того, производство антител, по своей сути предполагает определенную степень изменчивости, которая может добавить к проблеме получения весьма аналогичный продукт. Комплексный физико – химическая и биофизических характеристика и сравнение довольно сложно, но ряд исследований , демонстрирующих характеристики биоподобных антител появляются в литературе ^{7, 8, 9.}

Генерирование терапевтическое антитело начинается с трансфекции клеток-хозяев млекопитающих вектором, несущим гены, для соответствующего антитела. Вектор дизайн, линия клеток и условия культивирования являются ключевыми факторами для создания эксприжимное система.

ДНК-последовательности антител могут быть получены из банка медикаментов (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) или научных публикаций, включая патенты. Например, последовательность трастузумаба доступна через банк лекарственных средств (DB ID: DB00072). Аминокислотная последовательность вариабельных областей могут пройти проектирование и оптимизацию генов для синтеза в желаемых видов хозяев. Это важно для биоподобие антитела, никакие модификации не сделано в аминокислотной последовательности. После того, как синтезирован, гены антител могут быть субклонировали в соответствующий вектор выбора.

Человеческие антитела IgG состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей. Плотно регулируемую экспрессию обеих цепей имеет важное значение для оптимального производства гетерологичного белка IgG в клетках млекопитающих ^10. Внутри- а также дисульфидные связи между цепями должны быть сформированы и ряд посттрансляционных модификаций должны быть вtroduced в процессе биосинтеза белка. Ряд векторов доступны, которые были разработаны специально, чтобы выразить гены антител (см табл материалов). Эти векторы антитела специфичные обычно выражают постоянные области как для тяжелых и легких цепей, так только Вариабельные области каждой цепи требуют клонирования.

Трансфекция клеток с двумя независимыми конструкциями (Котрансфекция) является наиболее распространенным подходом для доставки тяжелых и легких цепей генов, кодирующих. То есть, каждый ген приводится в движение своего собственного промотора и транскрибируется в виде отдельных цепей антитела перед сборкой в ​​эндоплазматический ретикулум. С другой стороны, мульти-cistronic векторы имеют внутренние рибосомы сайте вступления (IRES) элементы , включенные , которые делают возможной экспрессию множественных генов как одного транскрипта мРНК с переводом разрешенной из внутренних областей мРНК ^11. В этом случае, тяжелые и легкие цепи гены, кодирующие соединены в Arrangement достичь коэкспрессии обоих цепей антитела ^{10, 12.}

В то время как трансфицированы клетки дают достаточное количество белка, чтобы выполнить ограниченное число экспериментов, стабильно трансфецированные клеточные линии, которые претерпели выбор для интеграции генома может обеспечить более высокие урожаи. Более высокие количества белка позволяют для развития анализа , относящейся к характеристике в пробирке и может обеспечивать индикацию качества антител в рассмотрении для последующих применений , таких как клональной клеточной линии и свинцового отбора кандидатов.

Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать стабильную экспрессию и очистку терапевтического антитела, продуцируемого в системе экспрессии млекопитающих. В самом деле, этот метод может быть применен к экспрессии биоподобие антитела. Метод может быть использован для начальной характеризации антител, прежде чем перейти к критическим, хотя и трудоемкого STEпс идентификации желаемого клона для увеличения производства масштаба. Более того, этот метод может быть использован, чтобы выразить другие белки, а не только антитела.

Следующее подробное протокол описывает экспрессию терапевтического антитело трастузумаб. Она состоит из подготовки векторной ДНК с последующей стабильной трансфекции в клеточной линии и очистки белка антитела НЕК-293 с помощью автоматизированного метода хроматографического.