Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Het succes van therapeutische antilichamen nog aanzienlijke investeringen rijden in de ontwikkeling van antilichamen als een golf van de volgende generatie therapeutica begint. Het antilichaam markt zal worden hervormd door ¹ antilichaamfragmenten, antilichaam-geneesmiddelconjugaten ² bispecifieke antilichamen ³ en gemanipuleerde antilichamen met gunstige eigenschappen ^4. Een andere klasse wint farmaceutische belang biosimilars. Biosimilar antilichamen zijn 'zeer vergelijkbaar' repliceren producten van een therapeutisch antilichaam dat al wettelijke goedkeuring heeft ontvangen. Een voorgestelde biosimilar moet vergelijkbaar zijn met de originator antilichaam met betrekking tot de structuur, functie, dierlijke toxiciteit klinische veiligheid en effectiviteit humane farmacokinetiek (PK), farmacodynamische (PD) en immunogeniciteit ^{5, 6} zijn.

De goedkeuring rAtes van biosimilar antilichamen zijn traag als gevolg van de strenge beperkingen op de uiteindelijke kwaliteit van het product. De precieze fabricageprocessen zoals specifieke cellijnen en kweekcondities tot de eindverwerking stappen bedrijfseigen zijn. Bovendien, de productie van antilichamen omvat inherent een zekere variabiliteit die aan de uitdaging van het produceren van een zeer soortgelijk product. Een uitgebreide fysiochemische en biofysische analyse en vergelijking is heel moeilijk, maar een aantal onderzoeken die de kenmerken van biosimilar antilichamen ontstaan in de literatuur ^{7, 8, 9.}

Genereren van een therapeutisch antilichaam begint bij transfectie van zoogdierlijke gastheercellen met een vector die de genen voor de respectievelijke antilichaam. Vector ontwerp, cellijn en de kweekomstandigheden zijn belangrijke overwegingen voor het opzetten van de expression systeem.

De DNA-sequenties van antilichamen kunnen afkomstig zijn van Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) of onderzoekspublicaties met inbegrip van octrooien. Bijvoorbeeld, de volgorde van trastuzumab is beschikbaar via Drug Bank (DB ID: DB00072). De aminozuursequentie van de variabele gebieden genen kunnen ontwerpen en optimaliseren ondergaan synthese in de gewenste gastheer species. Het is belangrijk voor een biosimilaire antilichaam dat geen wijziging is aangebracht in de aminozuursequentie. Eenmaal gesynthetiseerd kunnen antilichaam genen worden gekloneerd in de geschikte vector van keuze.

Humane IgG antilichamen bestaan ​​uit twee identieke zware ketens en twee identieke lichte ketens. Strak gereguleerde expressie van beide ketens essentieel voor de optimale productie van heteroloog IgG eiwit in zoogdiercellen ^10. Intra- en inter-keten disulfidebindingen te worden gevormd en een aantal post-translationele modificaties moeten introduced tijdens eiwit biosynthese. Een aantal vectoren zijn beschikbaar die speciaal ontworpen zijn om uit te drukken antilichaam genen (zie tabel of Materials). Deze antilichaam-specifieke expressie vectoren gewoonlijk de constante gebieden van zowel zware als lichte ketens zodat alleen de variabele gebieden van elke keten klonen vereisen.

Transfectie van cellen met twee onafhankelijke constructen (co-transfectie) is de meest gebruikte aanpak voor het leveren zware en lichte keten coderende genen. Dat wil zeggen dat elk gen aangedreven door zijn eigen promotor en getranscribeerd als afzonderlijke antilichaamketens alvorens te worden geassembleerd in het endoplasmatisch reticulum. Anderzijds, multi-cistronische vectoren interne ribosoom binnenkomstplaats (IRES) elementen opgenomen die expressie van meerdere genen als een enkel mRNA transcript met translatie toegelaten van inwendige gebieden van het mRNA ¹¹ mogelijk. In dit geval worden de zware en lichte keten coderende genen gekoppeld per arrangement co-expressie van beide antilichaamketens ^{10, 12} bereiken.

Terwijl tijdelijk getransfecteerde cellen leveren voldoende eiwit om een ​​beperkt aantal experimenten, kan stabiel getransfecteerde cellijnen die selectie hebben ondergaan genoom integratie hogere opbrengsten leveren. Hogere eiwit hoeveelheden zorgen voor testontwikkeling met betrekking tot in vitro karakterisering en kan een indicatie van de kwaliteit antilichaam in aanmerking voor downstream-toepassingen zoals klonale cellijn en lead kandidaat selectie.

Het doel van dit artikel is om de stabiele expressie en zuivering van een therapeutisch antilichaam geproduceerd in een zoogdier expressiesysteem beschreven. Inderdaad, kan deze methode worden toegepast om de expressie van een biosimilar antilichaam. De werkwijze kan worden gebruikt voor de initiële karakterisering van antilichamen alvorens naar de kritische, zij tijdrovend steps voor het identificeren van een gewenste kloon voor grootschaliger productie. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om andere eiwitten en niet alleen antilichamen tot expressie.

De volgende gedetailleerde protocol beschrijft de expressie van therapeutische antilichaam trastuzumab. Deze bestaat uit de bereiding van vector DNA gevolgd door stabiele transfectie in HEK-293 cellijn en zuivering van antilichaam eiwit door een geautomatiseerde chromatografische methode.