बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन सफल संक्रमणों की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल अपनी प्राकृतिक संयंत्र की मेजबानी में एक जीवाणु प्रेरक प्रोटीन की प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों की प्रयोगात्मक पहचान का वर्णन है। खमीर दो संकर स्क्रीन के माध्यम से इन प्रेरक बातचीत की पहचान आणविक pathogenicity रणनीतियों को उजागर करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है।
बीमारी अभिव्यक्तियों के आणविक तंत्र Unravelling संयंत्र विज्ञान के क्षेत्र में विकृतियों और लक्षण विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। बैक्टीरिया अपने स्वयं के लाभ के लिए अपने मेजबान चयापचय में हेरफेर करने के लिए अलग रणनीति विकसित किया है। यह जीवाणु हेरफेर अक्सर गंभीर लक्षण विकास या प्रभावित पौधों की मौत के साथ युग्मित है। मेजबान हेरफेर के लिए जिम्मेदार विशिष्ट जीवाणु अणुओं का निर्धारण सूक्ष्मजीवविज्ञानी अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन गया है। इन बैक्टीरिया के अणुओं कहा जाता है, की पहचान करने के बाद "प्रभावोत्पादक," यह उनके कार्य को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक स्पष्ट दृष्टिकोण निर्धारित करने के लिए एक प्रेरक का कार्य एक खमीर दो संकर (Y2H) स्क्रीन के माध्यम से अपनी प्राकृतिक मेजबानी में अपने प्रोटीन बाध्यकारी साथी की पहचान है। आम तौर पर मेजबान कई संभावित बंधन भागीदारों कि सिलिको एल्गोरिथ्म में से किसी ने पर्याप्त भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, बंदरगाहों। यह इस प्रकार perfo करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प हैमेजबान व्यक्त प्रोटीन की एक पूरी पुस्तकालय के खिलाफ काल्पनिक प्रेरक के साथ एक स्क्रीन RM। यह विशेष रूप से चुनौती दे रहा है, तो प्रेरणा का एजेंट phytoplasma तरह अकृष्य है। इस प्रोटोकॉल एक phytoplasma संक्रमित वुडी मेजबान संयंत्र, संभावित प्रेरक के प्रवर्धन, और एक Y2H स्क्रीन के साथ पौधे की आणविक बातचीत साथी के बाद पहचान से डीएनए शुद्धि के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है। हालांकि Y2H स्क्रीन आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं, वहाँ जैव प्रौद्योगिकी कंपनियों को लागत से Y2H सेवा की पेशकश करने के लिए इस तकनीक को आउटसोर्स करने के लिए एक प्रवृत्ति है। इस प्रोटोकॉल कैसे किसी भी शालीनता से सुसज्जित आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला मानक प्रयोगशाला तकनीक का उपयोग कर एक Y2H प्रदर्शन करने पर निर्देश प्रदान करता है।
खमीर दो संकर स्क्रीन (Y2H), 11 के बारे में 27 साल पहले 1 विकसित और के बाद से व्यापक रूप से विशिष्ट प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 निर्धारित करने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में इस्तेमाल किया गया है रहे थे । एक मेजबान के लक्ष्य प्रोटीन के साथ एक जीवाणु प्रेरक के भौतिक बातचीत अक्सर इस लक्ष्य प्रोटीन के कार्यात्मक हेरफेर के लिए पूर्व शर्त है। इन मुलाकातों का विश्लेषण संक्रमण जीव विज्ञान 12, 13, 14, 15 के कई अलग अलग क्षेत्रों का ध्यान केंद्रित करने के लिए ले जाया गया है,"> 16, 17, 18। Y2H स्क्रीन का सिद्धांत है कि दो प्रोटीन की बातचीत एक कार्यात्मक प्रतिलेखन कारक है कि रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव के पुनर्गठन की ओर जाता है। जाना जाता प्रेरक (" चारा ") translationally जुड़े हुए है डीएनए बाध्यकारी डोमेन प्रतिलेखन कारक की (DBD), और संभावित बातचीत भागीदारों ( "शिकार") संबंधित प्रतिलेखन कारक की सक्रियता के डोमेन (ई) से जुड़े हुए हैं। चूंकि बातचीत साथी अज्ञात, क्षमता का एक पुस्तकालय है interactors एक उपयुक्त शिकार वेक्टर अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में cDNAs क्लोनिंग विज्ञापन है कि चारा-वेक्टर इनकोडिंग DBD के साथ संगत है एन्कोडिंग द्वारा तथाकथित में क्लोन है "शिकार पुस्तकालय।" आम तौर पर, इस पुस्तकालय बना है। एक बातचीत के मामले में, पुनर्गठन प्रतिलेखन कारक रिपोर्टर जीन है, जो आम तौर पर खमीर के विकास चयन सक्षम की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित। Theinteractors की पहचान प्लाज्मिड विशिष्ट प्राइमरों के साथ शिकार प्लाज्मिड अनुक्रमण द्वारा हासिल की है।
बैक्टीरिया में हेरफेर और अपने मेजबान की चयापचय शोषण या सुरक्षा तंत्र से बचने और विभिन्न जीवाणु स्राव सिस्टम 19, 20, 21 के माध्यम से प्रेरक अणुओं का स्राव करने के लिए विभिन्न रणनीतियों को विकसित किया है। इन बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक के बंधन भागीदारों का निर्धारण इस प्रकार की मेजबानी में चालाकी से मार्ग की पहचान करने में पहला कदम है। इस विशिष्ट pathogenicity तंत्र का एक बेहतर समझ की ओर जाता है।
Y2H स्क्रीन phytoplasmoses दौरान बैक्टीरियल प्रेरक बातचीत की पहचान करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं, और अक्सर, Y2H phytoplasma अनुसंधान 22, 23 में आणविक pathogenicity तंत्र के आगे लक्षण वर्णन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक प्रयोग है। हालांकि, मुलाकातसबसे प्रकाशनों में विभागाध्यक्ष विवरण नहीं बल्कि दुर्लभ है, और इन तकनीकों अक्सर बायोटेक कंपनियों को आउटसोर्स कर रहे हैं। इस विधि की व्यवहार्यता की ओर ध्यान आकर्षित करने के लिए, इस प्रोटोकॉल कदम-दर-कदम जानकारी अपनी प्राकृतिक मेजबान में एक जीवाणु प्रेरक अणु की बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए प्रदान करता है।
व्यापक उपयोग और Y2H स्क्रीन के तेजी से आगे दृष्टिकोण के बावजूद, यह नहीं भूलना चाहिए कि कुछ बातचीत खमीर प्रणाली में घटित नहीं हो सकता है। यह सच है कि खमीर सेल कुछ जैविक सीमाओं के साथ "इन विवो प्रतिक्रिया पोत" का एक प्रकार के रूप में प्रयोग किया जाता है के कारण है। कई लेखकों फायदे और Y2H और उसके डेरिवेटिव 11, 24, 25, 26, 27 के नुकसान को संबोधित किया है। जनरल विचार उदाहरण के लिए, कर रहे हैं, कि खमीर सेल उचित नहीं प्रदान कर सकता हैजीन अभिव्यक्ति, (पोस्ट) translational, या संबंधित प्रोटीन के लिए translocational की स्थिति का अध्ययन किया जा रहा है। इस स्क्रीन में झूठी नकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। सकारात्मक बातचीत के बदले में कलाकृतियों हो सकता है और (उचित मेजबानी में यानी, प्रभावोत्पादक के मामले में) प्राकृतिक स्थिति में होते नहीं हो सकता है। इस प्रकार यह एक अधिक बारीकी से संबंधित जैविक प्रणाली में एक स्वतंत्र बातचीत परीक्षण के साथ heterologous खमीर अभिव्यक्ति प्रणाली से बातचीत की पुष्टि के लिए अपरिहार्य है।
इस अध्ययन में, गैर-कृषि योग्य संयंत्र रोगज़नक़ Candidatus Phytoplasma माली (पी माली) से प्रेरक ATP_00189 के बंधन भागीदारों की पहचान की गई। परिणाम सेब प्रसार 28, एक रोग है कि यूरोप में 29 प्रभावित सेब उत्पादक क्षेत्रों में उच्च आर्थिक नुकसान का कारण बनता है के लक्षण विकास अंतर्निहित आणविक तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
Y2H स्क्रीन में, संभावित प्रेरक प्रोटीन अलग काल्पनिक बातचीत प्रोटीन (चरण 7) के साथ सह व्यक्त की है। प्रत्येक बढ़ती खमीर क्लोन चारा लेकिन एक (संभावित) अलग interactor शामिल हैं। बातचीत के दौरान प्रोटीन है कि शिकार plasmids में क्लोन है एक सीडीएनए पुस्तकालय में इनकोड किया गया है। चारा और शिकार एक खमीर प्रतिलेखन कारक के एक भाग के लिए प्रत्येक सह cistronically कोड plasmids। चारा (प्रेरक) और एक प्लाज्मिड शिकार इनकोडिंग interactor के बीच शारीरिक बातचीत के मामले में दो प्रतिलेखन कारक भागों (डीएनए बाध्यकारी डोमेन और सक्रियण डोमेन) एकजुट हो रहे हैं, और पत्रकार जीन अभिव्यक्ति प्रेरित है। खमीर histidine- और adenine समाप्त एसडी चयन प्लेटों पर विकसित करने के लिए सक्षम है। शिकार सीडीएनए पुस्तकालय की तरह जांच की प्रेरक पर निर्भर है और उसके अनुसार चुना जाना चाहिए। शिकार और चारा वेक्टर, साथ ही खमीर तनाव, संगत होना चाहिए। इस स्क्रीन में, एक LexA डीएनए बाध्यकारी डोमेन और Gal4 सक्रियण domain संगत खमीर प्रतिलेखन कारक इकाइयों के रूप में इस्तेमाल किया गया। सीडीएनए पुस्तकालय को व्यक्तिगत रूप से निर्माण किया जा सकता है, कस्टम बनाया है, या व्यावसायिक रूप से प्राप्त की। सीडीएनए शिकार पुस्तकालय की तैयारी इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं है। इस प्रोटोकॉल में, एक आत्म-निर्माण किया है, Malus domestica एक्स के पत्तों की शाही सेना से सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय का इस्तेमाल किया और pGAD हा 41 में क्लोन किया गया था। प्रेरक (चारा) खमीर तनाव -expressing शिकार पुस्तकालय के साथ तब्दील हो गया था, और क्लोन histidine- और adenine समाप्त एसडी चयन प्लेटों पर चयन किया गया था। खमीर कालोनियों से प्लास्मिड डीएनए निकालने के लिए, बैक्टीरिया के लिए एक स्तंभ आधारित डीएनए प्लाज्मिड मिनी किट ग्लास मनकों का उपयोग खमीर सेल (चरण 8) में सुधार के लिए एक यांत्रिक व्यवधान कदम के साथ संयोजन में सिफारिश की है। इस प्लाज्मिड शुद्धि में, चारा और शिकार वेक्टर अपेक्षाकृत कम मात्रा में एक साथ शुद्ध हो जाएगा। हालांकि, प्लास्मिड डीएनए की मात्रा पर्याप्त है अनुक्रमण बुद्धि के माध्यम से बातचीत करने के लिए भागीदार की पहचानHout से पहले प्लाज्मिड प्रचार (कदम 8.4)। एक विकल्प के रूप में, डीएनए कदम 8.4 में शुद्ध सक्षम ई कोलाई के रूप में तब्दील और शिकार वेक्टर की मध्यस्थता एंटीबायोटिक प्रतिरोध के साथ चयनित (जैसे, pGAD हा के मामले में एम्पीसिलीन) हो सकता है। चुने गए ई कोलाई कालोनियों केवल pGAD हा पुस्तकालय प्लाज्मिड ले, और उच्च उपज प्लाज्मिड शुद्धि इन क्लोन के साथ किया जा सकता है।
pLexA-एन और pGAD हा निर्माणों के सफल परिवर्तन NMY51 की नियासिन और leucine auxotrophy पूरक। प्रेरक और एक प्रोटीन (pGAD हा पर इनकोडिंग) के बीच एक संवाद NMY51 उपभेदों में संवाददाता प्रणाली की सक्रियता के लिए होता है। आत्म सक्रियण के मामले में, NMY51 NMY51 संवाददाता प्रणाली के अवांछित सक्रियण के कारण प्रेरक खाली पुस्तकालय वेक्टर pGAD-हा-टीआरपी लियू-his-एडीई, कमी चयनात्मक प्लेटों पर बढ़ता के साथ संयोजन में pLexA-एन को व्यक्त करने के साथ बदल 40। आत्म सक्रियण w हो सकता हैउसकी टीआरपी-Leu-, या सक्रियण मजबूत और टीआरपी-Leu-his-एडीई प्लेटें 41 पर विकास द्वारा होती जा सकता eak और के अभाव में हो सकता है। स्व-सक्रियण वास्तविक Y2H स्क्रीन में झूठी सकारात्मक क्लोन के एक बड़े पैमाने पर पृष्ठभूमि पैदा कर सकता है। इससे बचने के लिए, चारे के साथ एक आत्म सक्रियण परीक्षण किया जाना चाहिए, जिसमें प्रेरक व्यक्त वेक्टर सह तब्दील खाली पुस्तकालय वेक्टर के साथ है। इस प्रयोगात्मक सेटिंग में, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित नहीं किया जाना चाहिए। यदि स्वयं सक्रियण (यानी, चयनात्मक प्लेटों पर विकास) की परीक्षा में दिख रहा है, मध्यम 3-अमीनो-1,2,4-triazole 45 (3-एटी) के विभिन्न सांद्रता के साथ पूरक हो सकते हैं। 3-एटी imidazoleglycerol-फॉस्फेट dehydratase (HIS3), एक एंजाइम हिस्टिडीन जैवसंश्लेषण 46 के दौरान महत्वपूर्ण के एक अवरोध है। 3-साथ पूरकता Y2H स्क्रीन 47 के दौरान स्वयं सक्रियण के कमजोर प्रभाव को कम कर सकते हैं,48। 3-एटी के विभिन्न सांद्रता परीक्षण किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, 1 – 40 मिमी 3-में इस्तेमाल किया गया। सबसे कम एकाग्रता कि स्वयं सक्रियण के दमन की ओर जाता है बाद में Y2H स्क्रीन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। आत्म सक्रियण परख के चुनिंदा प्लेटें ही मूल्यांकन किया जा सकता है, तो सह-परिवर्तन के एसडी टीआरपी-लियू प्लेटों क्लोन के लिए पर्याप्त संख्या में होते हैं। एक संकेत के रूप में ≥ प्रति 90 मिमी (व्यास) पेट्री डिश 500 कालोनियों के लिए पर्याप्त हैं। सटीक अभिकर्मक दक्षता का निर्धारण करने के लिए, यह सह-बदल खमीर के धारावाहिक dilutions तैयार करने के लिए और एसडी टीआरपी-लियू प्लेटों उन्हें प्रसार करने के लिए सिफारिश की है।
आत्म सक्रियण को कम करने के लिए, प्रेरक pLexA-सी, एक चारा अभिव्यक्ति वेक्टर कि प्रोटीन के सी-टर्मिनस तक LexA टैग फ़्यूज़ में क्लोन किया जा सकता है। लेक्स-एक टैग के उन्मुखीकरण आत्म सक्रियण 24 attenuate कर सकते हैं। हालांकि, यह हर मामले में कम या समाप्त आत्म सक्रियण के लिए संभव नहीं है। रचनालाल या लाल कालोनियों एक कमजोर या झूठी सकारात्मक बातचीत इंगित करता है। NMY51 की ade2 पत्रकार जीन केवल सक्रिय जब यह एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत करने के लिए आता है, जो बारी ब्लॉकों में इस खमीर तनाव 40 में एक लाल रंग का संचय। एक बातचीत के अभाव में, NMY51 जबकि मजबूत interactors ले जाने कालोनियों सफेद होते हैं, लाल कर रहे हैं। चयन प्लेटों पर कॉलोनी रंग का अवलोकन इस प्रकार का न्याय करने के लिए अगर संबंधित कालोनियों true- या झूठी सकारात्मक interactors हैं एक और महत्वपूर्ण संकेत है।
यह अंततः अनुकूलन या चारा की प्रकृति और बातचीत विशेषताओं के संबंध में कुछ परख सेटिंग में बदलाव करने के लिए आवश्यक है। अब तक, सुधार और आम Y2H के व्युत्पन्न तकनीकों का एक नंबर अलग मेजबान सिस्टम में नहीं बल्कि मुश्किल प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए स्थापित किया गया है। Stynen एट अल द्वारा एक समीक्षा। 49 पतों एकएन डी Y2H, अपने में सुधार, और रूपांतरों के विभिन्न पहलुओं का वर्णन है, और इस तरह कैसे उचित बातचीत परख का चयन करने के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है।
Y2H स्क्रीन और ली गई तकनीक का व्यापक रूप से विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में, जहाँ भी बाइनरी प्रोटीन बातचीत की पहचान के लिए आवश्यक है में इस्तेमाल हो गए हैं। महत्वपूर्ण नियंत्रण तरह के प्रलोभन के आत्म सक्रियण परीक्षण और पहचान बातचीत प्रोटीन की एक-से-एक फिर से परिवर्तनों के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं यहां तक कि अगर, Y2H झूठी परिणाम 26, 50, 51 का उत्पादन होने का खतरा है। एक मॉडल के रूप में खमीर सभी बातचीत के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है। खमीर जरूरी एक सेलुलर पर्यावरण उचित बाद translational संशोधन और हर प्रोटीन 24 के लिए तह का समर्थन करता है कि गठन नहीं है। इसके अलावा, Y2H की स्थापना में, प्रोटीन अधिक व्यक्त कर रहे हैं, और उनकी अभिव्यक्ति पर नियंत्रण नहीं हैउनके प्राकृतिक प्रमोटर के नेतृत्व में। Y2H नाभिक है, जो जरूरी उनके प्राकृतिक subcellular गंतव्य नहीं है करने के लिए प्रोटीन बातचीत में भागीदारों मजबूर करता है। बातचीत का मूल निवासी सेलुलर परिस्थितियों इस प्रकार खमीर से परिलक्षित नहीं किया जा सकता है और झूठी नकारात्मक या झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। अधिकांश Y2H एक चयनात्मक सिद्धांत के रूप में खमीर auxotrophy पूरक पर आधारित हैं। इस पोषण चयन उच्च संवेदनशीलता के द्वारा होती है, लेकिन अन्य की तुलना में कमी आई है चयनात्मकता की कीमत पर (जैसे, chromogenic संवाददाता) 49 assays। अगर unreducible आत्म सक्रियण (ऊपर देखें) या अन्य सीमाओं के एक निश्चित प्रेरक के लिए होते हैं, Y2H एक उपयुक्त परख 25 नहीं है। 1 टेबल और चित्रा 1 में, आत्म-सक्रियण परीक्षण के परिणाम की उम्मीद दिया जाता है। वास्तविक बातचीत (यानी, झूठी नकारात्मक) की अनुपस्थिति प्रोटीन विषाक्तता, गलत translational प्रोटीन की वजह से हो सकता हैबातचीत 24 के लिए आवश्यक संसाधन, बातचीत का steric बाधा, शिकार पुस्तकालय में underrepresented बातचीत भागीदारों, चारा की झिल्ली स्थानीयकरण, या लापता घटकों।
यह नए सिरे से करने की सिफारिश की है सीडीएनए से पहचान बातचीत प्रोटीन की पूरी लंबाई जीन बढ़ाना, pGAD हा में subclone, और उत्पन्न pGAD हा में निर्माण बदलने से एक एक-से-एक बातचीत परख प्रदर्शन चारा व्यक्त NMY51 तनाव। के बाद से मनाया interactor शिकार पुस्तकालय में मौजूद केवल एक बड़ा प्रोटीन का एक टुकड़ा हो सकता है यह आवश्यक है। हालांकि, संबंधित पूर्ण लंबाई जीन के लिए जानकारी केवल सुलभ यदि काफी जीनोमिक और transcriptomic अनुक्रम डेटा उपलब्ध है। आत्म सक्रियण यहाँ वर्णित परख के लिए परिवर्तन प्रोटोकॉल इस तरह के एक एक-से-एक परख के लिए लागू किया जा सकता है, और चारा और interactor के बीच बातचीत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना चाहिए।
<p clगधा = "jove_content"> एक Y2H स्क्रीन में पहचान की सहभागिता हमेशा एक और स्वतंत्र तकनीक द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए। यह स्वतंत्र तकनीक वास्तविक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की प्राकृतिक सेटिंग के करीब होना चाहिए। Phytoplasmal प्रेरक ATP_00189 के मामले में, Malus domestica एक्स के टीसीपी प्रतिलेखन कारक के साथ बातचीत निकोटियाना benthamiana में bimolecular फ्लोरोसेंट पूरक (BiFC) के साथ संयंत्र में सत्यापित किया गया था 28 (इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं) Protoplasts। प्रेरक प्रोटीन ATP_00189 संयंत्र रोगज़नक़ पी माली से निकाली थी। Planta BiFC में इस प्रकार Malus domestica एक्स प्रतिलेखन कारक के साथ बातचीत ATP_00189 सत्यापित करने के लिए चुना गया था पहले से Y2H 28 में पहचान की। BiFC एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत परख है कि आदेश संवाददाता प्रणाली <सक्रिय करने के नाभिक के लिए बातचीत प्रोटीन की subcellular translocation की आवश्यकता नहीं होती हैसमर्थन वर्ग = "xref"> 52। इसके अलावा, में संयंत्र अभिव्यक्ति और संशोधन मशीनरी mimics अपने संयंत्र की मेजबानी में संयंत्र बैक्टीरियल प्रेरक के बीच प्राकृतिक बातचीत का माहौल है। हालांकि, एक वैश्विक स्क्रीन BiFC का उपयोग संभव नहीं है।वहाँ प्रोटोकॉल है कि ध्यान से संबोधित किया जाना चाहिए में कई कदम उठाए हैं। जब ब्याज (चरण 4) के जीन amplifying, यह है कि प्राइमरों संयंत्र डीएनए के लिए बाध्य बाहर शासन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, गैर संक्रमित पौधों से डीएनए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाना चाहिए। ब्याज की जीन के अनुक्रम EcoRI और साली प्रतिबंध साइटों कि डालने की दिशात्मक क्लोनिंग के लिए उपयोग किया जाता है शामिल नहीं करना चाहिए। अनुक्रम इन साइटों को नियंत्रित करता है, तो क्लोनिंग के लिए अलग-अलग प्रतिबंध एंजाइमों चुना जाना चाहिए। खमीर परिवर्तन इस प्रोटोकॉल के दौरान एक केंद्रीय विधि है। अभिकर्मक दक्षता खमीर कोशिकाओं की योग्यता, उनकी व्यवहार्यता, विकास राज्य, और अभिकर्मक REAG की गुणवत्ता पर निर्भर करता हैईएनटी 53, 54। प्रस्तावित प्रोटोकॉल के लिए, यह अत्यधिक जब परिवर्तनों प्रदर्शन ताजा प्लेटों से खमीर दो सप्ताह (4 डिग्री सेल्सियस पर रखा) से अधिक पुराना नहीं का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। अक्सर, तब्दील हो खमीर के विकास को जब चयनात्मक तरल संस्कृतियों वर्ष अगर प्लेट से कालोनियों के साथ inoculated हैं देरी हो रही है। यह भी वास्तविक प्रयोगों के लिए एक inoculum के रूप में एक तरल स्टार्टर संस्कृति का उपयोग करें और थाली से सीधे खमीर का उपयोग नहीं करने के लिए उपयोगी है। जब चारा व्यक्त खमीर में शिकार परासंक्रमित कम दक्षता निश्चित शिकार प्रोटीन (संभावित interactors) की underrepresentation को जन्म दे सकता है और इस तरह पूरे स्क्रीन तिरछा कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, ~ 150,000 CFU / माइक्रोग्राम Y2H में ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए के एक खमीर अभिकर्मक दक्षता अच्छी तरह से काम किया।
खामियों और Y2H तकनीक की कमियों को जानने और एक गंभीर और उचित तरीके से परिणामों की व्याख्या CORR ड्राइंग के लिए अपरिहार्य हैect निष्कर्ष। Y2H assays और डेरिवेटिव कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है और विभिन्न चारा विशेषताओं के संबंध में कई सुधार और रूपांतरों आया है, बातचीत के subcellular स्थानीयकरण, उम्मीद बंधन भागीदारों, और अन्य कारकों है कि बातचीत के लिए आवश्यक हो सकता है (देखें Y3H 55, 56, 57)। हाल ही में, सरणी आधारित Y2H स्क्रीन विकसित किया गया है कि preys 58 के लाखों लोगों के खिलाफ कई फँसाना के स्वचालित, उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। भविष्य की संभावना सबसे अधिक जटिल संकेत दे रास्ते और विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में interactomes की व्याख्या के लिए अनुमति देने के लिए इस परख करने के लिए स्वचालन और उच्च throughput दृष्टिकोण में निहित है।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि proofreading के लिए Laimburg रिसर्च सेंटर और तकनीकी सहायता के लिए Dualsystems बायोटेक एजी और जूलिया Strobl से Mirelle बोर्जेस डायस Schnetzer से क्रिस्टीन Kerschbamer, थॉमस Letschka, सबीन Oettl, मार्गोट Raffeiner, और फ्लोरियन Senoner धन्यवाद। इस काम APPL2.0 परियोजना के हिस्से के रूप में प्रदर्शन किया गया था और आंशिक रूप से Bozen / बोलजानो, इटली के स्वायत्त प्रांत और दक्षिण Tyrolean एप्पल कंसोर्टियम द्वारा वित्त पोषित किया गया।
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Applichem | A6284 | for DNA preparation |
Trishydroxymethylaminomethane (Tris) | Applichem | A2264 | for media and buffer |
Sodiumchloride (NaCl) | Applichem | A2942 | for media and buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) | Applichem | A2937 | for media and buffer |
N-Lauroylsarcosin sodium salt | Applichem | A7402 | for DNA preparation |
ammonium acetate | Sigma-Aldrich (Fluka) | 9688 | for DNA preparation |
2-mercaptoethanol | Applichem | A1108 | for DNA preparation |
Isopropanol (2-Propanol) | Applichem | A3928 | for DNA preparation |
Ethanol | Sigma-Aldrich (Fluka) | 51976 | for DNA preparation |
RNAse | Applichem | A2760 | for DNA preparation |
Chloroform:Isoamyl 24:1 | Applichem | A1935 | for DNA preparation |
Proofreading Polymerase (e.g. iProof) | Bio-Rad | 203433 | for PCR |
EcoRI | Thermo Scientific | ER0271 | for cloning |
SalI | Thermo Scientific | ER0641 | for cloning |
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) | Qiagen | 28104 | for cloning |
Kanamycin Sulfate | Applichem | A1493 | for microbiological selection |
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Sigma-Aldrich | A8056 | for self-activation assay |
L-Arginine Monohydrochloride | Applichem | A3680 | for yeast culture |
L-Isoleucine | Applichem | A3642 | for yeast culture |
L-lysine Monohydrate | Applichem | A3448 | for yeast culture |
L-Methionine | Applichem | A3897 | for yeast culture |
L-Phenylalanine | Applichem | A3464 | for yeast culture |
L-Threonine | Applichem | A3946 | for yeast culture |
L-Tyrosine | Applichem | A3401 | for yeast culture |
L-Uracile | Applichem | A0667 | for yeast culture |
L-Valine | Applichem | A3406 | for yeast culture |
L-Adenine Hemisulfate Salt | Applichem | A1596 | for yeast culture |
0.22 µm Pore Filter | Sartorius | 16541 | for sterile filtration |
L-Histidine Monohydrochloride | Applichem | A3719 | for yeast culture |
L-Leucine | Applichem | A3496 | for yeast culture |
L-Tryptophane | Applichem | A3410 | for yeast culture |
Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | 51483 | for yeast culture |
D-Glucose Monohydrate | Applichem | A1349 | for yeast culture |
Agar | Fisher Scientific | BP2641-1 | for yeast and bacteria culture |
Peptone | Applichem | A2208 | for yeast culture |
Polyethylene Glycol 4000 (PEG) | Applichem | A1249 | for yeast transformation |
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) | Applichem | A3478 | for yeast transformation |
Salmon Sperm DNA | Applichem | A2159 | for yeast transformation |
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) | Millipore | 06-719 | for Western blot |
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) | Sigma-Aldrich | PLN350 | for plasmid purification from yeast and bacteria |
Acid Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | for plasmid purification from yeast |
Ampicillin Sodium Salt | Applichem | A0839 | for microbiological selection |
Yeast Extract | Applichem | A1552 | for yeast culture |
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) | Eppendorf | Z368245 (Sigma) | for DNA preparation |
Bait vector (e.g. pLexA-N) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
Prey vector (e.g. pGAD-HA) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
Control prey vector (e.g. pLexA-p53) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
Control bait vector (e.g. pACT-largeT) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) | Invitrogen | C640003 | for cloning |
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | for yeast and bacteria culture |
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) | Greiner | 676 051 | for yeast culture |
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) | Bio-Rad | 1861096 | for PCR |
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) | Bio-Rad | 1855195 | for quantitative PCR |
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) | Eppendorf | 5417 R | general lab equipment |
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) | Eppendorf | 5804 R | general lab equipment |
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) | 5Prime | 2500010 | for PCR and DNA works |
Scalpell | Swann-Morton | 0301 | for DNA preparation |
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone)) | VWR-International | 514-0073 (European Catalogue number) | for yeast and bacteria culture |
Petri dishes Ø 90 mm | Greiner Bio-One | 633180 | for yeast and bacteria culture |
Petri dishes Ø 150 mm | Greiner Bio-One | 639161 | for yeast culture |
Photometer (e.g. BioPhotometer) | Eppendorf | 550507804 | for yeast culture |
Photometer Cuvettes | Brand | 759015 | for yeast culture |
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) | Memmert | WB7 | for yeast transformation |
Western Blot Equipment | Bio-Rad | diverse | for protein detection |
dNTPs | 5Prime | 2201210 | for cloning |
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) | Sigma Aldrich | Z232793, Z232858, Z232866 | for yeast and bacteria culture |
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) | GFL | 3031 | for yeast and bacteria culture |
Incubator | Binder | KB 53 (E3.1) | for yeast and bacteria culture |
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) | Omniwash | IF 825 | general lab equipment |
0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene) | Eppendorf | 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) | general lab equipment |
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 µl) | Eppendorf | diverse | general lab equipment |
Spreader | Sigma-Aldrich | SPR-L-S01 | for yeast and bacteria culture |
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) | IKA | 3617000 | general lab equipment |
T4-Ligase | Thermo Fisher | EL0011 | for cloning |
Fridge (4°C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) | Liebherr | 81.767.580.4 | general lab equipment |
Freezer (-20°C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) | Liebherr | G5216 | general lab equipment |
Graduated Cylinder (e.g. Brand) | Sigma Aldrich | Z327352; Z327417; Z327441 | general lab equipment |
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) | Thermo Fisher | S55701 | for yeast and bacteria culture |
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) | Integra-Biosciences | 155000 | general lab equipment |
Cuvettes for Electroporation (1 mm) | Molecular Bio Products | 5510-11 | for bacteria transformation |
Electroporator (e.g. Eporator) | Eppendorf | 4309000019 | for bacteria transformation |
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) | Bio-Rad | 1708280 | general lab equipment |
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml) | VWR-International | 525-0403 (European Catalogue number) | general lab equipment |
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml) | BD Falcon | 352096 | general lab equipment |
Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M) | Thermo Scientific | P2325 | for ligation |
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) | Ambion | AM8110G (distributed by Thermo Scientific) | for ligation |
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) | Sigma-Aldrich | Y2021 Sigma | for yeast culture (ready-made mix) |