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Immunologia e infezioni

Démêler la fonction d'un effecteur bactérien à partir d'un non-cultivable Pathogen usine utilisant une levure de l'écran à deux hybrides

Published: January 20, 2017
doi:
10.3791/55150
,
1Department of Molecular Biology – Functional Genomics,Laimburg Research Centre

Summary

protéines effectrices bactériennes sont importantes pour établir des infections réussies. Ce protocole décrit l'identification expérimentale des partenaires de liaison protéiques d'une protéine bactérienne effecteur dans son hôte naturel de plantes. L' identification de ces interactions effectrices via levure écrans à deux hybrides est devenu un outil important dans le décryptage des stratégies de pathogénicité moléculaires.

Abstract

Démêler les mécanismes moléculaires de manifestations de la maladie est important de comprendre les pathologies et le développement des symptômes de la science des plantes. Les bactéries ont évolué différentes stratégies pour manipuler leur métabolisme hôte pour leur propre bénéfice. Cette manipulation bactérienne est souvent couplée avec le développement des symptômes graves ou la mort des plantes touchées. Détermination des molécules bactériennes spécifiques responsables de la manipulation de l'hôte est devenu un domaine important dans la recherche microbiologique. Après l'identification de ces molécules bactériennes, appelés "effecteurs", il importe d'élucider leur fonction. Une approche simple pour déterminer la fonction d'un effecteur est d'identifier son partenaire de liaison protéinique dans son hôte naturel via un écran deux hybrides de levure (Y2H). Normalement , l'hôte héberge de nombreux partenaires de liaison potentiels qui ne peuvent pas être prédits de manière suffisante par tout dans l' algorithme silico. Il est donc le meilleur choix pour perform un écran avec l'effecteur hypothétique contre toute une bibliothèque de protéines de l'hôte exprimées. Il est particulièrement difficile si l'agent causal est incultivables comme phytoplasme. Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour purification d'ADN à partir d'une usine de phytoplasme infectés ligneuse hôte, l'amplification de l'effecteur potentiel, et l'identification subséquente de moléculaire partenaire d'interaction de la plante avec un écran de Y2H. Même si les écrans Y2H sont couramment utilisés, il y a une tendance à externaliser cette technique pour les sociétés de biotechnologie qui offrent le service de Y2H à un coût. Ce protocole fournit des instructions sur la façon d'effectuer une Y2H dans un laboratoire de biologie moléculaire décemment équipée en utilisant des techniques de laboratoire standard.

Introduction

Levure écrans à deux hybrides (Y2H) ont été mis au point il y a environ 27 ans 1 et ont depuis été largement utilisé dans divers domaines afin de déterminer les interactions spécifiques protéine-protéine 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . L'interaction physique d'un effecteur bactérien avec une protéine cible de l'hôte est souvent la condition sine qua non pour la manipulation fonctionnelle de cette protéine cible. L' analyse de ces interactions a été déplacée à l'objet de nombreux secteurs différents de l' infection de la biologie 12, 13, 14, 15,"> 16, 17, 18. Le principe de l'écran Y2H est que l'interaction de deux protéines conduit à la reconstitution d'un facteur de transcription fonctionnel qui entraîne l'expression des gènes rapporteurs. L'effecteur connu (le« appât ») est traductionnelle fusionné au domaine de liaison d'ADN (DBD) du facteur de transcription, et les partenaires d'interaction potentiels ( «proie») sont fusionnées au domaine d'activation (AD) du facteur de transcription correspondant. Étant donné que le partenaire d'interaction est inconnue, une bibliothèque de potentiel interacteurs est clone dans le soi-disant «proie-bibliothèque." Normalement, cette bibliothèque est faite par le clonage des ADNc dans un vecteur de proie plasmide d'expression approprié codant pour l'AD qui est compatible avec l'appât-vecteur codé DBD. Dans le cas d'une interaction, la les facteurs de transcription reconstituées induisent l'expression de gènes rapporteurs, qui permettent généralement la sélection d'une levure de croissance. laidentification des interacteurs est obtenue par séquençage du plasmide proie avec des amorces spécifiques de plasmide.

Les bactéries ont développé diverses stratégies pour manipuler et exploiter le métabolisme de leur hôte ou de se soustraire à des mécanismes de défense et de sécréter des molécules effectrices via différents systèmes de sécrétion bactériens 19, 20, 21. La détermination des partenaires de liaison de ces effecteurs bactériens est donc la première étape dans l'identification de la voie de réglage dans l'hôte. Cela conduit à une meilleure compréhension des mécanismes de pathogénicité spécifiques.

Écrans Y2H sont effectués pour identifier les interactions effectrices bactériennes pendant phytoplasmoses, et souvent, Y2H est une première expérience cruciale pour la caractérisation plus poussée des mécanismes de pathogénicité moléculaires dans la recherche de phytoplasme 22, 23. Cependant, le rencontréDescription hod dans la plupart des publications est plutôt rare, et ces techniques sont souvent confiée à des sociétés de biotechnologie. Pour attirer l'attention sur la faisabilité de cette méthode, ce protocole fournit des informations étape par étape pour identifier les partenaires d'interaction d'une molécule d'effecteur bactérien dans son hôte naturel.

Malgré la large utilisation et l'approche avance rapide des écrans Y2H, il ne faut pas oublier que certaines interactions pourraient ne pas se produire dans le système de levure. Ceci est dû au fait que la cellule de levure est utilisé comme une sorte de "in vivo récipient de réaction" avec certaines limitations biologiques. Plusieurs auteurs se sont penchés sur les avantages et les inconvénients de Y2H et ses dérivés 11, 24, 25, 26, 27. Considérations générales sont, par exemple, que la cellule de levure peut ne pas fournir appropriél'expression génique, (post) translation ou à des conditions translocation des protéines respectives à l'étude. Cela peut conduire à des résultats faussement négatifs dans l'écran. Les interactions positives peuvent à leur tour être artefacts et peuvent ne pas se produire dans la situation naturelle (ie, en cas d'effecteurs dans l'hôte approprié). Il est donc indispensable pour confirmer les interactions du système d'expression de levure hétérologue par un test d'interaction indépendante dans un système biologique plus étroitement liés.

Dans cette étude, les partenaires de liaison de la ATP_00189 effecteur de l'agent pathogène de la plante non-cultivable Candidatus Phytoplasma Mali (P. Mali) ont été identifiés. Les résultats fournissent des informations importantes sur les mécanismes moléculaires sous – jacents au développement des symptômes de la pomme prolifération 28, une maladie qui provoque des pertes économiques élevées dans les régions productrices de pommes touchées en Europe 29.

Protocol

1. Collecte racines et feuilles échantillons de pommiers infectés Remarque: l'ADN Pathogen spécifique peut être purifié à partir de racines ou de feuilles. La section suivante fournit un protocole pour l'échantillonnage des deux. Pour la préparation de l'ADN collecte des échantillons et préparation des racines Identifier les arbres infectés avec "pomme" prolifération symptômes spécifique de 30, 31 et des arbres témoins qui sont sans symptômes. À l'aide des sécateurs coupe nette des échantillons de racines qui ont un diamètre de 0,5 – 1 cm et une longueur d'environ 5 cm. Des échantillons coupés dans trois sites distants, différents du système racinaire, et les mettre dans des sacs en plastique étiquetés de manière adéquate. Gardez les échantillons dans une boîte isotherme avec des accumulateurs thermiques réfrigérés et les stocker dans le réfrigérateur à 4 ° C jusqu'à ce que le traitement ultérieur. Remarque: l'architecture des racines et de la structure peut varier par rapport à l'état physiologique of l'arbre. Il est important de prélever sur trois sites différents et de ne pas prendre des radicelles trop minces. Les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs jours à 4 ° C, mais de plus longues durées de stockage augmentent le risque de moulage. les échantillons moisis ne peuvent pas être utilisés pour la préparation de l'ADN. Rincer les échantillons de racines avec de l'eau pour enlever le sol. Mettez-les dans une boîte de Pétri stérile et utiliser un scalpel stérilisé pour éliminer l'épiderme des racines et le cortex. Nettoyer le scalpel avec un tissu propre et sans peluches essuyez, le tremper dans 70% (v / v) de l' eau de l' éthanol, et à la chaleur stériliser sur une flamme nue (par exemple, le brûleur Bunsen). Grattez le phloème avec le scalpel, couper en petits morceaux, et aliquote 30 – 100 mg du phloème haché dans un ml tube de réaction stérile 2.0. Conserver les échantillons à -80 ° C pendant plusieurs mois. la collecte et la préparation des feuilles échantillon Identifier un infecté et d'un arbre de contrôle asymptomatique, uns décrits dans l'étape 1.1.1.1 et ramasser dix feuilles indemnes par arbre. Un arbre par condition est suffisante. Rincer les feuilles avec de l'eau et nettoyer les surfaces par pulvérisation 70% (v / v) d'éthanol. Mettez les feuilles dans une boîte de Pétri stérile et disséquer la nervure centrale (veine centrale) de chaque feuille avec un scalpel stérile. Retirer l'épiderme et du cortex de la nervure centrale, couper la nervure centrale en petits morceaux, et aliquote de 100 mg du tissu midrib dans un tube de réaction de 2,0 ml stérile. Utilisez les échantillons immédiatement pour la préparation ou un magasin d'ADN à -80 ° C pendant plusieurs mois. Remarque: Il est commode de aliquoter la matière végétale dans des portions de 100 mg et éventuellement de les congeler pour le stockage. Chaque aliquote peut être utilisé directement pour la préparation de l'ADN. Pesée matériel végétal surgelé est lourd, puisque le matériel végétal congelé tend à former des morceaux. 2. cétyltriméthylammonium Bromure (BCAT) à base d'ADN Préparation <p class = "jove_content"> Remarque: L'ADN peut être purifié en utilisant tout procédé de purification d'ADN à base de colonne pour le matériel végétal. Dans cette section, une méthode basée sur CTAB pour la purification de l'ADN est décrite. La purification de l' ADN est réalisée sur la base d' un protocole modifié décrit par ailleurs 32. Préparer les tampons suivants: Tampon CTAB: Dissoudre 1% p / v de bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB, M: 364,45 g / mol), 100 mM de trishydroxyméthylaminométhane (Tris, M: 121,14 g / ml), 1,4 M de chlorure de sodium (NaCl, M r: 58,44 g / mol) et 20 mM éthylènediaminetétraacétique sel disodique de l' acide (NaEDTA, M: 372,24 g / mol) dans de l' eau et de les ajuster à un pH de 8,0. Tampon N-Lauroylsarcosine: dissoudre 10% p / v de sel de sodium de N-lauroylsarcosine 33 (M r: 293,38 g / mol), 100 mM de Tris et 20 mM de NaEDTA dans l' eau et ajuster le pH à 8,0. Tris-EDTA (TE) du tampon: dissoudre 10 mM de Tris et 1 mM de NaEDTA dans l'eau et autoclave la solution. Une solution d'acétate d'ammonium: Préparation d' un 5 M d' acétate d'ammonium (M r: 77,0825 g / mol) dans de l' eau et on l' autoclave à 120 ° C et 1,2 bar pendant 20 min. Mélanger 30 – 100 mg de matière fraîche ou congelée plante hachée (étape 1.1.2.2.) Avec 300 pi de tampon CTAB, 30 ul de tampon N-Lauroylsarcosine, 6 pi de proteinase K (10 ug / ul) et 12 ul de 2-mercaptoéthanol 34 (M r: 78,13 g / mol). Agiter pendant 60 min à 60 ° C. Laissez le mélange refroidir à température ambiante avant de procéder. Ajouter 360 ul d'une solution d'acétate d'ammonium et mélanger vigoureusement. Laisser reposer la solution pendant 5 min, puis centrifuger à 15000 xg pendant 10 min à température ambiante. Transférer le surnageant dans un flacon propre et ajouter 720 pi de l' isopropanol glacé 35. Précipiter l'ADN pendant au moins 30 min à -20 ° C. Centrifuger le mélange à 15 000 g pendant 30 min à 4° C et jeter le surnageant. Laver le culot avec 500 pi de glace-froid à 70% d'éthanol et le tourner vers le bas à 15 000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant d'éthanol et plonger immédiatement le flacon sur une serviette en papier propre pour éliminer les gouttelettes résiduelles. Assurez-vous d'enlever autant de liquide que possible. Sécher à l'air le culot pendant 15-20 min ou pendant 2-3 min dans une centrifugeuse de concentrateur sous vide. Ne pas trop sécher le culot par chauffage en excès ou les temps d'évaporation prolongées. Remettre en suspension le culot dans 700 pl de tampon TE et, éventuellement, réchauffer à 37 ° C pour faciliter la dissolution. Ajouter 10 ul de RNase (10 ug / ul) et on incube pendant 15 min à 37 ° C, en agitant à 300 tours par minute. Ajouter 700 ul de chloroforme: alcool isoamylique 36 24: 1 et bien mélanger. Centrifuger le mélange à 20.000 xg pendant 10 min à 4 ° C et transférer la phase supérieure du surnageant dans un nouveau, flacon propre. Précipiter l'ADN dans le surnageant par addition d'700 pi de 2-propanol 35 (isopropanol, M: 60,1 g / mol) et l' incubation pendant au moins 30 min à -20 ° C. Centrifuger le mélange à 12.000 xg pendant 30 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Laver le culot avec 500 pi d'éthanol à 70% et centrifuger à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C. Sécher le culot comme décrit à l'étape 2.5. Le dissoudre dans 50 pi de TE. 3. Détection de Candidatus Phytoplasma ADN Mali spécifique par PCR Diluer l'ADN purifié à partir de la matière végétale 1:10 dans l' eau sans nucléase et exécuter une PCR avec des amorces spécifiques des agents pathogènes 37. Vérifier la présence d'ADN de P.-Mali spécifique dans la matière végétale en utilisant un protocole de PCR quantitative avec des amorces et des sondes spécifiques pour P. phytoplasme Mali 37. Vérifier l'absence d'autres membres de la phytoplasmoses 16SrX en effectuant la PCR avec les mêmes sondes respectives pour Cand. P. prunorum et Cand. P. pyri ADN 37. NOTE: L'ADN à partir d'un arbre non infectée doit être testée et pour confirmer l'absence d'un agent pathogène dans ce contrôle. À cette étape, il est important que l'ADN provenant d'autres espèces de phytoplasmes étroitement liés est absent dans l'échantillon, car cela augmenterait le risque d'amplifier l'effecteur d'une espèce de phytoplasme autres que P. Mali. Une infection mixte avec un autre P. Mali groupe phytoplasme 16SrX étroitement liée est exclue par l'analyse de l'échantillon avec les sondes respectives. Étant donné que les résultats attendus doivent être négatifs pour d'autres phytoplasme 16SrX, il est important d'inclure les contrôles positifs appropriés qui indiquent l'efficacité PCR. 4. Amplifier le potentiel effecteur Gene et sous-clonage dans le vecteur Y2H Appât Amplifier le atp_00189 du gène phytoplasme (ne comprenant pas la partie du peptide signal) de P. Mali en utilisant les amorces 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (avant) et 5 TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (marche arrière), avec des sites de restriction pour EcoRI et Sali aux extrémités 5 'et 3' des extrémités, respectivement. On purifie le produit PCR à un procédé de purification d'ADN à base de colonne. Clone l'amplicon dans le vecteur Y2H d'appât pLexA-N par EcoRI et SalI ligature. NOTE: Ici, 100 ng de EcoRI et SalI linéarisé pLexA-N vecteur a été combiné avec 15 ng de similaire digéré atp_00189 amplicon PCR et 1 U T4-ligase. La ligature a été effectuée dans un tampon contenant 40 mM de Tris-HCl (pH 7,9 à 25 ° C), 10 mM de MgCl2, 10 mM de dithiothréitol (DTT, M: 154,25 g / mol), et 0,5 mM d' adénosine triphosphate (ATP, M r: 507,18 g / mol) dans un volume total de 10,0 ul à 16 ° C pendant une nuit (14-20 h). Analyser l'ADN de l'arbre infecté avec les mêmes amorces pour écarter la liaison à Malus x domestica amorce non spécifique </Em> ADN. Transform 1 ul du mélange de ligature dans E. coli cellules électrocompétentes et sélectionner des clones résistants à la kanamycine sur Luria-Bertani (LB) plaques complétées avec 50 pg / ml de sulfate de kanamycine 38. Purifier l'ADN plasmidique des clones bactériens sélectionnés avec un plasmide mini kit de préparation à base de colonne suivant les instructions du fabricant, et vérifier l'intégration réussie et l' orientation de l'insert par séquençage 39. 5. Essai pour l'auto-activation (Auto-activation) de l'effecteur Protein Potential Préparer les tampons suivants et milieux de croissance: NOTE: La nomenclature des levures sélective des plaques coupe les abréviations des acides aminés manquants dans le milieu respectif avec un "-" avant l'abréviation. Par exemple, SD-trp-LEU-ses plaques contiennent tous les acides aminés, mais trp, leu et son. 10x décrocheur mix: Peser200 mg de L-arginine , monochlorhydrate (M r: 210,66 g / mol), 300 mg de L-isoleucine (M r: 131,17 g / mol), 269 mg de L-lysine monohydratée (M r: 164,21 g / mol), 200 mg de L-méthionine (M r: 149,21 g / mol), 500 mg de L-phénylalanine (M r: 165,19 g / mol), de 2 g de L-thréonine (M r: 119,12 g / mol), 300 mg de la L-tyrosine (Mr: 181,19 g / mol), 200 mg de L-uracile (112,09 g / mole) et 1,5 g de L-valine (R M: 117,15 g / mol). Dissoudre les dans 1 L d'eau distillée deux fois et autoclave la solution. Conserver la solution à 4 ° C. NOTE: Le mélange d'abandon respectif peut être prémélangée aussi acheté. 10x L-adénine supplément: Peser 100 mg de sel de L-adénine hémisulfate (ade, M r: 184.17 g / mol) et le dissoudre dans 50 ml d'eau distillée deux fois. Stériliser par filtration la solution avec un filtre à pores de 0,22 um. 10x L-histidine supplément: Peser 100 mg de L-histidine monohydraté (son, M r </sub>: 209.63 g / mol) dans 50 ml d'eau distillée deux fois et le filtre stériliser avec un filtre à pores de 0,22 um. 10x L-leucine complément: Peser 500 mg de L-leucine (leu, M: 113,17 g / mol) dans 50 ml d'eau bidistillée et stériliser par filtration avec un filtre à pores de 0,22 um. 10x L-tryptophane supplément: Peser 100 mg de L-tryptophane (trp, M: 204,23 g / mol) dans 50 ml d'eau bidistillée et stériliser par filtration avec un filtre à pores de 0,22 um. SD-trp-leu-his-ade-support et des plaques: Dissoudre 0,67% en poids / volume de base azotée de levure (sans acides aminés) et 2% p / v de D-glucose monohydraté (M r: 198,17 g / mol) en double- eau et autoclave distillée. Pour les plaques d'agar-agar, ajouter 2% p / v d'agar (qualité microbiologique) avant l'autoclavage. Pour préparer des plaques sélectives, ajouter 1x de la solution mère d'acide aminé au milieu Sd-trp-leu-his-ade autoclavé. Lors de la préparation des plaques, assurez-vous que l'agar est refroidi à ~ 50 ° C avant d'ajouterles acides aminés. Gardez les solutions mères stériles. Milieu YPAD: On dissout 1% p / v d' extrait de levure, 2% p / v de peptone (qualité microbiologique), 0,004% p / v de sel adénine hémisulfate (M r: 184,17 g / mol) et de 2% en poids / volume de glucose monohydrate eau et autoclave double distillation. Pour les plaques d'agar YPAD, ajouter 2% p / v de gélose avant l'autoclavage. 2x pour préparer YPAD, utiliser deux fois les concentrations des ingrédients mentionnés ci-dessus. Remarque: (Facultatif) En raison de la forte concentration de glucose dans le milieu, le milieu 2x YPAD devient sombre brunâtre après autoclavage. En variante, 40% (p / v) de solution mère de glucose peut être préparé et stérilisé en le faisant passer à travers un filtre de 0,22 um. Le glucose solution mère stérilisée par filtration est ensuite ajouté à la 2x YPAD autoclavé (de glucose manquant) dans des conditions stériles. Pour éviter les erreurs de volume, le 2x YPAD doit être préparé, en gardant à l'esprit qu'une solution 10x glucose est ensuite ajouté. Cela veut dire que, par exemple, au lieu de 1 L omoyen f, seulement 900 ml est préparée (contenant tous les ingrédients sauf le glucose) et l'autoclave, puis 100 ml de solution mère de glucose est ajouté. Lithium acétate médiée par transformation de la levure pour les tests d'auto-activation Streak la souche Saccharomyces cerevisiae rapporteur NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2: :( LexAop) 4-HIS3 ura3: :( LexAop) 8-lacZ ade2: :( LexAop) 8-ADE2 GAL4) à partir d' un congelé stock de glycérol sur une plaque de gélose YPAD et incuber pendant 48 h à 30 ° C. Prélever des colonies de cette plaque et ensemencer 50 ml de milieu YPAD. Laissez la levure à croître et à mesurer l'OD 600 régulièrement pour surveiller la croissance. Laissez la levure croître à une DO finale 600 de 0,5-0,8. Sédimenter les cellules en les centrifugeant à 700 g pendant 5 min et les remettre en suspension dans 2,5 ml d'eau bidistillée autoclavée. Préparer six aliquotes de 100 ul de suspension de levure et ajouter 240 ul de 50% P / v de polyethylene glycol 4000 (PEG, M r: 3.500-4.000 g / mol), 36 pl de 1 M d' acétate de lithium dihydraté (LiOAc, M: 102,02 g / mol) et 25 ul de 2% p / v ADN de sperme de saumon (dissous). Préparer tous les réactifs avec de l'eau double distillée stérile. Etiqueter les six flacons contenant la suspension de levure de "a" à "f" et ajouter l'ADN du vecteur plasmidique suivant: contrôles négatifs: (a) 1,5 pg d'appât plasmide avec l'effecteur (pLexA-N-atp00189 28), (b) 1,5 pg de vide proies plasmide pGAD-HA 41, (c) 1,5 pg d'appât vecteur vide pLexA-N 41, et (d) 1,5 ug d'appât vecteur vide pLexA-N et 1,5 pg de vide proies plasmide pGAD-HA; contrôles positifs: (e) 1,5 pg de positif contrôle appât ADN plasmidique pLexA-p53 41 et 1,5 pg de positif proie plasmide Pact-LARGET 41; et le test d'auto-activation: (f) 1,5 pg de bail plasmide avec l'effecteur (pLexA-N-atp00189) et 1,5 pg de vide proies plasmide pGAD-HA. Mélanger énergiquement les réactions et les incuber pendant 45 min à 42 ° C dans un bain d'eau. Pellet les cellules pendant 5 min à 700 xg et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 250 ul de 0,9% (p / v) d'une solution de chlorure de sodium (NaCl, M r: 48,44 g / mol) et de se propager 50 ul sur des plaques sélectives suivantes: SD-Trp, SD-leu, SD-Trp- leu, SD-trp-leu-son, et SD-trp-leu-his-ade. Incuber les plaques pendant 3 – 4 jours à 30 ° C. Après le premier jour d'incubation, on scelle les plaques avec un film de paraffine plastique pour empêcher les plaques de se dessécher. Vérifiez la croissance de la levure sur les plaques. 6. Testez l'expression de l'effecteur Tester l'expression de l'effecteur 42 par Western blot avec un anticorps dirigé contre le marqueur Lex-A qui est couplé à l' extrémité N-terminale de l'effecteur lorsqueexprimée à partir de pLexA-N. Remarque: Considérez que la Lex-A tag traductionnelle fusionné ajoute environ 24 kDa au poids réel de la protéine d'intérêt. Ceci est important lors de l'identification de la taille de la protéine dans le Western Blot. 7. L'écran Y2H Streak l'pLexA-atp00189 (effecteur) -transformed NMY51 sur une plaque SD-trp fraîche et laisser grandir pour 2 – 3 jours à 30 ° C, jusqu'à ce que les colonies rouges apparaissent. Ensemencer 3 ml de milieu SD-trp dans un petit ballon en secouant avec une colonie rouge de la plaque de gélose et incuber une nuit à 30 ° C sous agitation à 120-150 rpm. Inoculer 20 ml de SD-trp dans un ballon en secouant avec 1 ml de la culture pendant la nuit et le laisser grandir pendant 8 h. Ajuster la culture à DO 600 = 0,2 en ajoutant du milieu SD-trp et ensemencer 2x 100 ml dans l' agitation de ballons avec 10 ml de la culture de départ chacun. Cultivez la nuit avec agitation à 30 ° C. Remarque: Assurez – vous que la levure ne pousse pas à OD 600> 0,5 et diluer avec frais SD-trp. Mesurer la DO 600 et le culot 120 OD 600 «unités». Par exemple, si une DO 600 de 1,2 est mesurée, centrifuger 100 mL, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 800 ml de pré-chauffé 2x YPAD dans un flacon d'agitation avec un barreau d'agitation magnétique. Isoler une partie aliquote de 2 ml, éliminer le surnageant et remettre le culot dans l'eau. Veiller à ce que la DO 600 de la suspension de levure est comprise entre 0,15 et 0,2. Sinon, ajustez avec 2x YPAD ou ajouter plus de levure à partir de la culture de la nuit. Remarque: 2x YPAD est brun foncé et peut affecter les résultats de la mesure de la DO. Par conséquent, il est nécessaire de remettre en suspension les cellules de levure dans de l'eau avant la détermination de la DO. En variante, 2x YPAD peut être préparée par la stérilisation du glucose séparément, comme décrit dans la note étape 5.1.8, ce qui empêche la coloration noire du milieu. Incuber la culture de levure restant dans une applicationropriately taille flacon shaker (800 mL dans un 2 L agitateur flacon ou diviser 2 x 400 ml en deux flacons 1 L secoueurs) et incuber à 30 ° C, 120-150 rpm. Mesurer la DO 600 environ tous les 1,5 h jusqu'à ce qu'une DO 600 de 0,6 est atteint (prend 4-6 h). Pendant ce temps, préparer les solutions décrites dans l'étape suivante. transformation à l'acétate de lithium à médiation Dissoudre 2% p / ADN de sperme de saumon v dans l'eau et faire bouillir 500 pi pendant 5 min dans un bain d'eau à 100 ° C. Placer le tube sur de la glace pendant 2 minutes et répéter l'étape de chauffage. Gardez l'ADN sur la glace jusqu'à utilisation ultérieure. Préparer les mélanges suivants: TE / LiOAc mélange: Mélanger 3,08 ml de 1 M LiOAc, 3,08 ml de Tris 100 mM / EDTA 10 mM (pH: 7,5), et 21,84 ml d'eau bidistillée stérile. PEG / LiOAc mélange: Mélanger 4,2 ml de 1 M LiOAc, 4,2 ml de Tris / EDTA 10 mM (pH: 7,5) et 33,6 ml de 50% (p / v) de PEG 4000. Centrifuger la culture de levure 800 ml (DO600 = 0,6)à 700 g pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 200 ml d'eau double distillée stérile. Pellet les cellules à nouveau à 700 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Remarque: Si nécessaire fracture de la suspension dans plusieurs flacons pour centrifugation. Les volumes de liquide en 7.7.3. et 7.7.4. se référer à l'ensemble culot dérivé de 800 ml de suspension. Reprendre le culot dans 16 ml de TE / LiOAc mix (voir étape 7.7.1.1); centrifuger à 700 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Reprendre le culot dans 9,6 ml de TE / LiOAc mix. Préparer la réaction suivante se mélange de taille appropriée navires réaction de polypropylène: 12 flacons de 7 pg de vecteur bibliothèque pGAD-HA-ADNc, 100 pi de 2% d'ADN de sperme de saumon (voir étape 7.7), et 2,5 ml de PEG / LiOAc mélange. Ajouter 600 pl de suspension de cellules de levure provenant de l'étape 7.10 à chacun des 12 flacons et mélanger vigoureusement pendant 1 min. Incuber le mélange réactionnel pendant 45 min à 30 ° C dans un bain d'une eauD mélanger énergiquement toutes les 15 min. Ajouter 160 pi de DMSO à chaque flacon et mélanger vigoureusement. Incuber le mélange pendant 20 minutes à 42 ° C. Sédimenter les cellules à 700 xg pendant 5 minutes, jeter le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 3 ml de 2x YPAD. Piscine toutes les cellules (avec un total de 36 ml à partir de 12 flacons) dans un shaker flacon de 100 ml et incuber la levure pendant 90 min à 30 ° C et 120 rpm. Pellet les cellules pendant 5 min à 700 xg et jeter le surnageant. Reprendre le culot dans 4,5 ml de stérile à 0,9% (p / v) de NaCl et bien mélanger soigneusement pipetant avec une pipette sérologique de 10 ml. Retirer 50 ul et préparer des dilutions par dix en NaCl à 0,9% de 1:10 jusqu'à 1: 1000. Plaque 100 ul de chaque dilution dans des boîtes de Pétri de 90 mm contenant de la gélose SD-trp-leu. Etalez le reste de la levure resuspension non dilué sur 16- x 150 mm de diamètre plats de Pétri avec agar SD-trp-leu-his-ade. Ajouter 3-AT au milieu pour réduire l'auto-activation. Incuber le SD-trp-leuplaques pour trois jours et trois plaques SD-trp-leu-ses-ade pendant quatre jours à 30 ° C. NOTE: Les clones qui apparaissent sur les plaques sélectives sont (potentiels) paires en interaction et portent le plasmide codant pGAD-HA pour l'appât interagissant partenaire. Déterminer l'efficacité de transfection en comptant les colonies des différentes dilutions en série sur des plaques de sélection SD-Trp-Leu. Transférer chaque clone en choisissant et striant la colonie avec une pointe de pipette stérile sur des plaques SD-trp-leu-his-ade-sélective frais. Incuber les plaques pendant 24 h à 30 ° C. Répétez cette étape tous les jours jusqu'à un total de cinq passages est atteint. 8. Analyse des clones à partir des plaques sélectives Préparer un tube de réaction de 2 mL stérile avec 1 ml de SD-trp-leu-his-ade pour chaque clone sous une hotte stérile. Percez un trou dans chaque tube avec une aiguille chaude et couvrir le trou avec un morceau de scellant perméable au gaz. Inoculer chaque flacon avec colonie compagnon frais rial d'un clone (étape 7.17; utiliser des clones après la 5 ème passage) et incuber pendant 24 h à 30 ° C, en agitant à 150 tours par minute. NOTE: Il est important de prendre des clones à partir d'une plaque fraîche, parce que la levure provenant des plaques stockées pendant plusieurs jours à 4 ° C ne poussent pas suffisamment dans les 24 h dans un milieu liquide. Pellet la levure pendant 5 min à 4000 g et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot dans le tampon de remise en suspension approprié (du kit miniprep d'ADN plasmidique respectif) et le transférer vers un nouveau tube de réaction de 2,0 ml. Ajouter 100 ul de perles de verre lavées à l'acide (425- 600 um de diamètre) et mélanger vigoureusement pendant 5 min. Ajouter le tampon de lyse correspondant et procéder à la purification de plasmide en utilisant un mini kit de préparation de plasmide suivant les instructions du fabricant. Éluer l'ADN plasmidique avec 50 ul d'eau. Utiliser l'ADN de l'étape 8.3 pour une réaction de séquençage avec l'amorce spécifique du plasmide proie, GAL4ADseqref "> 41 5'ACCACTACAATGGATGATG -3 '. Vérifier l'interaction de novo co-transformation 43, 44 l'appât et le vecteur de proie. Sélectionnez la levure transformée sur des plaques de sélection SD-trp-leu-his-ade.

Representative Results

Avant l'écran réel Y2H peut être effectuée l'appât doit être testé pour l'auto-activation. Ce résultat est obtenu en transformant le vecteur d'expression de l'appât en même temps que la bibliothèque de proies vecteur vide et de contrôle de croissance sur des plaques sélectives. Pour analyser si la ATP_00189 de protéine phytoplasme est auto-activation, le test d' auto-activation a été réalisée comme décrit dans la section 5. Le plasmide appât complète le trp et la proie plasmid l'auxotrophie leu de S. cerevisiae NMY51 40. Une co-transformation réussie est donc caractérisé par une croissance sur des plaques sélectives manquent trp et leu. L'interaction de l'appât et une protéine proie conduit à une complémentation de la sienne et ade auxotrophie de NMY51. Si l'auto-activation par l'appât en l'absence d'une interaction apparaît, la levure se développe sur des plaques sélectives manquent son et ade. auto forte et faibleactivation peut se produire. Une forte auto-activation de l'appât est caractérisée par une croissance de la levure co-transformée sur trp-leu-his-ade appauvri des plaques de sélection. Faible auto-activation conduit à la croissance sur trp-leu-son mais pas sur trp-leu-his-ade appauvri plaques de sélection. contrôles positifs appropriés sont indispensables pour interpréter les résultats du test d'auto-activation. Un résumé des résultats attendus de l'essai d' auto-activation et leur interprétation sont fournis dans le tableau 1 et visualisés sur la figure 1. Figure 1: Exemple de Bait Tests d' auto-activation d'un appât Avant d' effectuer un écran de Y2H. S. cerevisiae NMY51 a été co-transformé avec interaction appât (pLEX-p53) et la proie (Pact-LARGET) comme témoin positif (panneau de gauche: ac), une auto-activation , plus une proie vide libra faiblementvecteur ry (panneau du milieu: df) et un appât pas d'auto-activation , plus une bibliothèque de proies vecteur vide (panneau de droite: gi). La levure de co-transformées ont été cultivées sur des plaques de SD dépourvues trp et leu (panneau supérieur: a, d, g), trp, leu et son (panneau du milieu: b, e, h) et trp, leu, son et ade (inférieure panneau: c, f, i). La sélection sur un milieu dépourvu de trp et leu est un contrôle positif pour la co-transformation réussie, en tant que vecteur appât complète le auxotrophie trp et le vecteur proie l'auxotrophie leu de NMY51 (croissance sur SD-trp-leu). Dans le cas d'une interaction entre l'appât et la proie ou une auto-activation de l'appât, l'expression de rapporteur de NMY51 est allumé et complète le sien et ade auxotrophie (croissance sur SD-trp-leu-his-ade). Une faible auto-activation se caractérise par une croissance sur SD-trp-LEU-ses plaques (panneau du milieu, df). Faible auto-activation d'un appât doit être diminuée avant pour analyser l'appâtdans un écran de Y2H, par exemple en ajoutant 3-AT aux médias sélectifs. épuisements d'acides aminés sont indiqués par "-" dans le nom du support respectif. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. pLexA-N-atp00189 aucun colonies pas de croissance pas de croissance pas de croissance pas de croissance aucun pGAD-HA pas de croissance colonies pas de croissance pas de croissance pas de croissance pLexA-N aucun colonies pas de croissance pas de croissance pas de croissance pas de croissance pLexA-N pGAD-HA colonies colonies <td> colonies pas de croissance pas de croissance pLexA-p53 Pact-LARGET colonies colonies colonies colonies colonies pLexA-N-atp00189 pGAD-HA colonies colonies colonies pas de croissance pas de croissance Tableau 1: Résultats attendus dans un Bait Assay auto-activation. La transformation de S. cerevisiae donne NMY51 à croissance différentielle sur des milieux sélectifs en fonction des caractéristiques de l' appât et la proie de co-transformé. La croissance sur des plaques sélectives a été évaluée lors de la transformation de différentes combinaisons de vecteurs (af) après 72 heures d'incubation à 30 ° C. Faible auto-activation est caractérisée par la croissance de la levure sur SD-trp-leu-son et une forte auto-activation par la croissance sur la sélection SD-trp-leu-his-ade plates en l'absence d'un partenaire d'interaction. Le pLexA-N phytoplasme codé effecteur ATP_00189 ne présentent pas d'auto-activation, qui est caractérisé par l'incapacité du vecteur appât transformé NMY51 à croître en l'absence de son et ade. En fonction de l'appât, un écran de Y2H peut obtenir de nombreux clones de levure en croissance sur des plaques sélectives. Tous les clones doivent être analysées et vérifiées pour les licenciements possibles. Même si une banque d'ADNc normalisée a été utilisé, il est très probable qu'une interacteur est représentée dans plusieurs clones différents. En fonction de la technique de clonage bibliothèque, il est également possible que seuls des fragments du gène complet sont insérés dans des vecteurs proies. Il est donc conseillé de novo amplifier ( à partir d' ADNc) et sous – cloner le gène de la longueur de l'interacteur et de tester l'interaction dans une analyse de Y2H one-to-one (Figure 2). <img alt = "Figure 2" src = "/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg" /> Figure 2: Exemple d'une interaction entre l' appât et proie dans une expérience de Y2H. Un écran à deux hybrides de levure (Y2H) a été effectuée et ont été purifiés à partir de plasmides clones Interactor positifs. Le vecteur de proie a été séquencée et les Malus x domestica partenaires d'interaction hôte MdTCP24 et MdTCP25 ont été identifiés. En tant que MdTCP34 de contrôle négatif (pour lesquels aucun interacteur a été identifié dans l'écran de la bibliothèque Y2H) a été sous-cloné en parallèle. Les gènes de longueur complète ont été amplifiés à partir de la pomme d' ADNc, sous – cloné dans le vecteur proie (exprimant la co-cistronically le domaine d' activation AD) et de novo , la co-transformée avec le vecteur appât exprimant le ATP_00189 effecteur bactérien couplé au domaine de liaison à l' ADN (BD). Ce chiffre est tiré de 28. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

Discussion

Dans l'écran de Y2H, la protéine effecteur potentiel est co-exprimé avec différentes protéines interagissant hypothétiques (étape 7). Chaque levure clone contient de plus en plus l'appât, mais un (potentiellement) interacteur différent. Les protéines qui interagissent sont codés dans une banque d'ADNc est clone dans des plasmides de proie. L'appât et la proie plasmides chaque code co-cistronically pour une partie d'un facteur de transcription de levure. Dans le cas d'une interaction physique entre l'appât (effecteur) et un interacteur codé par un plasmide proie, les deux parties de facteur de transcription (le domaine de liaison à l'ADN et le domaine d'activation) sont réunies, et l'expression du gène rapporteur est induite. La levure est capable de croître sur des plaques de sélection SD et histidine adénine appauvrie. Le genre de banque d'ADNc proie dépend de l'effecteur tamisé et doit être choisie en conséquence. Le vecteur de proie et appât, ainsi que la souche de levure, doivent être compatibles. Dans cet écran, un ADN LexA domaine et le domai d'activation Gal4 liaisonn ont été utilisés comme unités de facteur de transcription de levure compatibles. La banque d'ADNc peut être construite individuellement, fabriqués sur mesure, ou obtenu dans le commerce. La préparation de la banque d'ADNc proie ne fait pas partie de ce protocole. Dans ce protocole, une banque d'ADNc normalisée auto-construit à partir de l'ARN de feuilles Malus x domestica a été utilisé et clone dans pGAD-HA 41. L'effecteur (appât) exprimant la souche de levure a été transformée avec la bibliothèque de proies, et les clones ont été sélectionnés sur des plaques de sélection SD et histidine adénine appauvrie. Pour extraire l'ADN de plasmide à partir des colonies de levure, un ADN plasmidique mini kit à base de colonne pour les bactéries est recommandée en combinaison avec une étape de rupture mécanique en utilisant des billes de verre pour améliorer la lyse des levures (étape 8). Dans cette purification du plasmide, l'appât et le vecteur proie sont purifiés simultanément à des concentrations relativement faibles. Cependant, la quantité d'ADN plasmidique est suffisant pour identifier le partenaire d'interaction par séquençage d'esprithout propagation plasmidique avant (étape 8.4). En guise d'alternative, l'ADN a été purifié à l' étape 8.4 peut être transformé dans des cellules compétentes E. coli et sélectionné avec des proies la résistance aux antibiotiques induite par vecteur (par exemple l'ampicilline dans le cas de la pGAD-HA). Le E. coli choisi colonies ne transportent que la bibliothèque plasmidique pGAD-HA, et à haut rendement de purification de plasmide peut être effectué avec ces clones.

La transformation réussie de pLexA-N et pGAD-HA constructions complète le tryptophane et la leucine auxotrophie de NMY51. Une interaction entre l'effecteur et une protéine (codée sur pGAD-HA) conduit à l'activation du système rapporteur dans NMY51 souches. Dans le cas de l'auto-activation, NMY51 transformée avec l'effecteur exprimant pLexA-N en combinaison avec la bibliothèque vecteur vide pGAD-HA se développe sur des plaques sélectives manquent trp-leu-his-ade, en raison de l'activation involontaire du système rapporteur NMY51 40. L'auto-activation peut être weak et peut se produire en l'absence de trp-leu-son, ou l'activation peut être forte et caractérisée par une croissance sur des plaques trp-leu-his-ade 41. Auto-activation peut causer un fond massif de clones faux positifs dans l'écran réel de Y2H. Pour éviter cela, un test d'auto-activation avec l'appât doit être effectuée, dans lequel le vecteur d'expression effecteur est co-transformée avec le vecteur vide bibliothèque. Dans ce cadre expérimental, l'expression du gène rapporteur ne doit pas être induite. Si l' auto-activation ( par exemple, la croissance sur des plaques sélectives) est visible lors de l'essai, le milieu peut être complété avec des concentrations différentes de 3-amino-1,2,4-triazole 45 (3-AT). 3-AT est un inhibiteur de imidazoleglycerol-phosphate déshydratase (HIS3), une enzyme importante pendant 46 biosynthèse de l' histidine. Supplémentation avec 3-AT peut réduire les effets faibles de l' auto-activation pendant les écrans de Y2H 47,48. Différentes concentrations de 3-AT doivent être testés. Dans ce protocole, 1-40 mM de 3-AT ont été utilisées. La plus faible concentration qui conduit à la répression de l'auto-activation doit être ensuite utilisée dans l'écran de Y2H. Les plaques sélectives de l'essai d'auto-activation ne peuvent être évaluées si les plaques de SD-Trp-Leu de la co-transformation contiennent un nombre suffisant de clones. Comme ≥ indication 500 colonies par 90 mm (diamètre) boîte de Pétri sont suffisantes. Pour déterminer l'efficacité de la transfection exacte, il est recommandé de préparer des dilutions en série de la levure co-transformée et les étalées sur des plaques de SD-Trp-Leu.

Afin de réduire l'auto-activation, l'effecteur peut être clone dans pLexA-C, un vecteur d'expression de l'appât qui fusionne l'étiquette LexA à l'extrémité C-terminale de la protéine. L'orientation du-A Lex tag peut atténuer l' auto-activation 24. Cependant, on ne peut dans tous les cas à réduire ou supprimer l'auto-activation. La formation decolonies rouges ou rougeâtres indique une interaction faible ou de faux positifs. Le gène rapporteur ADE2 de NMY51 est activé seulement en ce qui concerne une interaction protéine-protéine, ce qui bloque à son tour l'accumulation d'un colorant rouge dans cette souche de levure 40. En l'absence d'une interaction, NMY51 sont rougeâtres, tandis que les colonies portant interacteurs fortes sont blanches. L'observation de la couleur des colonies sur les plaques de sélection fournit ainsi un autre indice important pour juger si les colonies respectives sont interacteurs TRUE- ou faux-positifs.

Il est éventuellement nécessaire d'adapter ou de modifier certains paramètres de l'essai par rapport à la nature de l'appât et les caractéristiques d'interaction. A l'heure actuelle, un certain nombre d'améliorations et de techniques dérivées de la Y2H commune ont été mis en place pour permettre l'analyse des interactions des protéines plutôt difficiles dans les systèmes hôtes différents. Un examen par Stynen et al. 49 adresses d' unnd décrit les différents aspects de Y2H, ses améliorations et adaptations, et fournit des informations utiles sur la façon de choisir le test d'interaction appropriée ainsi.

écrans Y2H et techniques dérivées sont devenus largement utilisés dans les différents domaines de recherche, où l'identification des interactions entre protéines binaires est nécessaire. Même si les contrôles critiques sont effectués, tels que des tests d' auto-activation de l'appât et un-à-un re-transformations des protéines interagissant identifiées, l'Y2H est enclin à produire de faux résultats 26, 50, 51. La levure comme modèle ne convient pas à toutes les études d'interaction. La levure ne constitue pas nécessairement un environnement cellulaire qui prend en charge la modification post-traductionnelle appropriée et pliage pour chaque protéine de 24. En outre, dans le cadre de Y2H, les protéines sont sur-exprimés, et leur expression est pas le contrôleconduits par leur promoteur naturel. Le Y2H force les partenaires d'interaction protéinique du noyau, qui ne sont pas nécessairement leur destination subcellulaire naturel. Les circonstances cellulaires natives de l'interaction peuvent donc pas être reflétés par la levure et peut conduire à des résultats faussement négatifs ou faussement positifs. La plupart des Y2H sont basées sur la levure auxotrophie complémentation comme un principe sélectif. Cette sélection nutritionnelle est caractérisée par une sensibilité élevée, mais au prix d' une diminution de la sélectivité par rapport à d' autres (par exemple, reporter chromogénique) Dosages 49. Si unreducible auto-activation (voir ci – dessus) ou d' autres limitations se produisent pour un certain effecteur, l'Y2H est pas un dosage approprié 25. Dans le tableau 1 et la figure 1, les résultats attendus du test d' auto-activation sont donnés. L'absence d'interactions réelles (c. -à- faux négatifs) peut être causée par la toxicité de la protéine, la protéine de traduction incorrectetraitement, l' encombrement stérique de l'interaction, les partenaires d'interaction sous – représentés dans la bibliothèque proie, la localisation de la membrane de l'appât, ou manquants composants nécessaires à l'interaction 24.

Il est recommandé de novo amplifier le gène de pleine longueur de la protéine interagissant identifié à partir d' ADNc, sous – cloner dans pGAD-HA, et d' effectuer un essai d'interaction one-to-one en transformant le pGAD-HA généré construction dans l'appât exprimant souche NMY51. Ceci est nécessaire étant donné que l'interacteur observé présent dans la bibliothèque de proies ne peut être un fragment d'une protéine plus grande. Toutefois, les informations pour le gène de pleine longueur respective est accessible uniquement si les données considérables de séquence génomique et transcriptomique est disponible. Le protocole de transformation pour le dosage d'auto-activation décrit ici peut être utilisé pour un tel test en un-à-un, et l'interaction entre l'amorce et la interacteur doit être reproductible.

<p class = "jove_content"> Interactions identifiées dans un écran de Y2H doit toujours être confirmé par une autre technique indépendante. Cette technique indépendante doit être plus proche de l'environnement naturel de la réelle interaction protéine-protéine. Dans le cas de l'ATP_00189 phytoplasme effecteur, l'interaction avec les facteurs de transcription TCP de Malus x domestica a été vérifiée in planta avec bimoléculaire complémentation fluorescent (BiFC) chez Nicotiana benthamiana protoplastes 28 (ne fait pas partie de ce protocole). La ATP_00189 de protéine effectrice a été dérivé de l'agent pathogène de la plante P. Mali. Dans planta BiFC a donc choisi de vérifier les interactions avec les ATP_00189 x domestica facteurs de transcription Malus précédemment identifiés dans le 28 Y2H. BiFC est une interaction dosage protéine-protéine qui ne nécessite pas la translocation subcellulaire des protéines qui interagissent au noyau afin d'activer le système rapporteur <sup class = "xref"> 52. En outre, les planta dans l' expression et de la machinerie de modification imite l'environnement de l'interaction naturelle entre l'effecteur bactérien de la plante dans son plante hôte. Cependant, un écran global à l'aide BiFC est impossible.

Il y a plusieurs étapes dans le protocole qui doit être soigneusement pris en compte. Lors de l'amplification du gène d'intérêt (étape 4), il est important d'exclure que les amorces se lient à l'ADN de la plante. Ainsi, l'ADN à partir de plantes non infectées doit être incluse en tant que contrôle négatif. La séquence du gène d'intérêt ne doit pas contenir des sites de restriction Eco RI et Sal I qui sont utilisés pour le clonage directionnel de l'insert. Si la séquence contient ces sites, les différentes enzymes de restriction pour le clonage doivent être choisis. transformation de la levure est une méthode centrale au cours de ce protocole. L'efficacité de transfection dépend de la compétence des cellules de levure, la viabilité, l'état de croissance et la qualité du REAG de transfectionent 53, 54. Pour le protocole proposé, il est fortement recommandé d'utiliser la levure à partir de plaques fraîches pas plus de deux semaines (conservées à 4 ° C) lors de l'exécution des transformations. Souvent, la croissance de la levure transformée est retardée lorsque des cultures liquides sélectifs sont inoculés avec les colonies de vieilles plaques de gélose. Il est également utile d'utiliser une culture starter liquide comme inoculum pour les expériences réelles et ne pas utiliser la levure directement à partir de la plaque. Faible efficacité quand transfecter la proie dans la levure d'appât exprimant peut conduire à la sous-représentation de certaines protéines des proies (des interacteurs potentiels) et peut donc fausser tout l'écran. Dans ce protocole, une efficacité de transfection de levure de ~ 150 000 ufc / pg d'ADN transfectées dans le Y2H a bien fonctionné.

Connaître les défauts et les inconvénients de la technique de Y2H et interpréter les résultats d'une manière critique et appropriée est indispensable à l'élaboration de la correct conclusions. essais Y2H et les dérivés ont été utilisés pendant de nombreuses années et ont subi de nombreuses améliorations et adaptations par rapport aux différentes caractéristiques d'appât, la localisation subcellulaire de l'interaction, les partenaires de liaison attendus et d'autres facteurs qui pourraient être nécessaires pour l'interaction (voir Y3H 55, 56, 57). Récemment, les écrans de Y2H tableau à base ont été développées qui permettent une analyse automatisée, à haut débit de nombreux appâts contre des millions de proies 58. L'avenir est plus probable dans l'automatisation et à haut débit des approches à cet essai pour permettre l'élucidation des voies et interactomes de signalisation complexes dans des domaines de recherche différents.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner et Florian Senoner du Centre de recherche Laimburg et Mirelle Borges Dias Schnetzer de Dualsystems Biotech AG pour le soutien technique et Julia Strobl pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet de APPL2.0 et a été partiellement financé par la Province autonome de Bozen / Bolzano, Italie et du Tyrol du Sud d'Apple Consortium.

Materials

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Applichem A6284 for DNA preparation
Trishydroxymethylaminomethane (Tris) Applichem A2264 for media and buffer
Sodiumchloride (NaCl) Applichem A2942 for media and buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) Applichem A2937 for media and buffer
N-Lauroylsarcosin sodium salt Applichem A7402 for DNA preparation
ammonium acetate  Sigma-Aldrich (Fluka) 9688 for DNA preparation
2-mercaptoethanol Applichem A1108 for DNA preparation
Isopropanol (2-Propanol) Applichem A3928 for DNA preparation
Ethanol Sigma-Aldrich (Fluka) 51976 for DNA preparation
RNAse Applichem A2760 for DNA preparation
Chloroform:Isoamyl 24:1 Applichem A1935 for DNA preparation
Proofreading Polymerase (e.g. iProof) Bio-Rad 203433 for PCR
EcoRI Thermo Scientific ER0271 for cloning
SalI Thermo Scientific ER0641 for cloning
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) Qiagen 28104 for cloning
Kanamycin Sulfate Applichem A1493 for microbiological selection
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Sigma-Aldrich A8056 for self-activation assay
L-Arginine Monohydrochloride  Applichem A3680 for yeast culture
L-Isoleucine  Applichem A3642 for yeast culture
L-lysine Monohydrate  Applichem A3448 for yeast culture
L-Methionine  Applichem A3897 for yeast culture
L-Phenylalanine  Applichem A3464 for yeast culture
L-Threonine  Applichem A3946 for yeast culture
L-Tyrosine  Applichem A3401 for yeast culture
L-Uracile Applichem A0667 for yeast culture
L-Valine  Applichem A3406 for yeast culture
L-Adenine Hemisulfate Salt  Applichem A1596 for yeast culture
0.22 µm Pore Filter Sartorius 16541 for sterile filtration
L-Histidine Monohydrochloride Applichem A3719 for yeast culture
L-Leucine  Applichem A3496 for yeast culture
L-Tryptophane  Applichem A3410 for yeast culture
Yeast Nitrogen Base  Sigma-Aldrich 51483 for yeast culture
D-Glucose Monohydrate  Applichem A1349 for yeast culture
Agar Fisher Scientific BP2641-1 for yeast and bacteria culture
Peptone Applichem A2208 for yeast culture
Polyethylene Glycol 4000 (PEG) Applichem A1249 for yeast transformation
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) Applichem A3478 for yeast transformation
Salmon Sperm DNA  Applichem A2159 for yeast transformation
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) Millipore 06-719 for Western blot
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) Sigma-Aldrich PLN350 for plasmid purification from yeast and bacteria
Acid Washed Glass Beads Sigma-Aldrich G8772 for plasmid purification from yeast
Ampicillin Sodium Salt Applichem A0839 for microbiological selection
Yeast Extract Applichem A1552 for yeast culture
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) Eppendorf Z368245 (Sigma) for DNA preparation
Bait vector (e.g. pLexA-N) Dualsystems P01004 for Y2H
Prey vector (e.g. pGAD-HA) Dualsystems P01004 for Y2H
Control prey vector (e.g. pLexA-p53) Dualsystems P01004 for Y2H
Control bait vector (e.g. pACT-largeT) Dualsystems P01004 for Y2H
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) Invitrogen C640003 for cloning
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) Dualsystems P01004 for Y2H
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) Sigma-Aldrich P7793-1EA for yeast and bacteria culture
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) Greiner 676 051 for yeast culture
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) Bio-Rad 1861096 for PCR
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) Bio-Rad 1855195 for quantitative PCR
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) Eppendorf 5417 R general lab equipment
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) Eppendorf 5804 R general lab equipment
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) 5Prime 2500010 for PCR and DNA works
Scalpell Swann-Morton 0301 for DNA preparation
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone)) VWR-International 514-0073 (European Catalogue number) for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 90 mm  Greiner Bio-One 633180 for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 150 mm  Greiner Bio-One 639161 for yeast culture
Photometer (e.g. BioPhotometer) Eppendorf 550507804 for yeast culture
Photometer Cuvettes Brand 759015 for yeast culture
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) Memmert WB7 for yeast transformation
Western Blot Equipment Bio-Rad diverse for protein detection
dNTPs 5Prime 2201210 for cloning
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) Sigma Aldrich Z232793, Z232858, Z232866 for yeast and bacteria culture
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) GFL 3031 for yeast and bacteria culture
Incubator Binder KB 53 (E3.1) for yeast and bacteria culture
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) Omniwash IF 825 general lab equipment
0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene) Eppendorf 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) general lab equipment
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 µl) Eppendorf diverse general lab equipment
Spreader Sigma-Aldrich SPR-L-S01 for yeast and bacteria culture
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) IKA 3617000 general lab equipment
T4-Ligase Thermo Fisher EL0011 for cloning
Fridge (4°C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) Liebherr 81.767.580.4 general lab equipment
Freezer (-20°C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) Liebherr G5216 general lab equipment
Graduated Cylinder (e.g. Brand) Sigma Aldrich Z327352; Z327417; Z327441   general lab equipment
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) Thermo Fisher S55701 for yeast and bacteria culture
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) Integra-Biosciences 155000 general lab equipment
Cuvettes for Electroporation (1 mm) Molecular Bio Products 5510-11 for bacteria transformation
Electroporator (e.g. Eporator) Eppendorf 4309000019 for bacteria transformation
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) Bio-Rad 1708280 general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml) VWR-International  525-0403 (European Catalogue number) general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml) BD Falcon 352096 general lab equipment
Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M) Thermo Scientific P2325 for ligation
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) Ambion  AM8110G (distributed by Thermo Scientific) for ligation
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) Sigma-Aldrich Y2021 Sigma  for yeast culture (ready-made mix)
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Riferimenti

  1. Fields, S., Song, O. -. K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -. M., Corey, S. -. J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -. J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -. W., Gates, P. -. B., Garza-Garcia, A. -. A., Brockes, J. -. P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -. Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -. H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22 (2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -. J. -. M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835 (2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors – a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423 (2002).
  33. Applichem. . N-Lauroylsarcosine sodium salt. , (2015).
  34. Applichem. . 2-Mercaptoethanol. , (2015).
  35. Applichem. . 2-Propanol. , (2015).
  36. Applichem. . Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. . Kanamycin sulfate. , (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , 1917-1952 (2008).
  41. . Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit – Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -. T., Scofield, R. -. H. . Protein Blotting and Detection. , (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. . . Yeast Transformation and Cloning. , (2016).
  45. Sigma-Aldrich. . 3-Amino-1,2,4-triazole. , (2016).
  46. Ames, B. -. N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -. K., Ramm, E. -. I., Pabo, C. -. O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -. B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -. H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -. O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -. R., Yuan, L., Yuan, L., Perry, E. S. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -. S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -. R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

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Janik, K., Schlink, K. Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen. J. Vis. Exp. (119), e55150, doi:10.3791/55150 (2017).
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