Opklaringen af ​​funktion en Bakteriel Effector fra et ikke-dyrkbare Plant patogener Ved hjælp af en Gær To hybrid skærm

1. Indsamling Root og Leaf Prøver fra inficerede æbletræer Bemærk: Patogen-specifik DNA kan oprenses fra rødder eller blade. Det følgende afsnit giver en protokol for prøveudtagning af begge. Til DNA-fremstilling samling Sample og forberedelse fra rødderne Identificer inficerede træer med "æble spredning"-specifikke symptomer 30, 31 og kontrol træer, der er symptomfri. Brug af rene beskæresakse, skåret rodprøver, der har en diameter på 0,5 – 1 cm og en længde på omkring 5 cm. Cut prøver fra tre forskellige, fjerne steder i rodsystemet, og sætte dem ind i tilstrækkeligt mærket plastikposer. Opbevar prøverne i en kold kasse med kølede termiske packs og gemme dem i køleskabet ved 4 ° C indtil videre forarbejdning. Bemærk: Root arkitektur og struktur kan variere i forhold til den fysiologiske status of træet. Det er vigtigt at udtage prøver fra tre forskellige steder og ikke at indtage for-tynde rodspirer. Prøverne kan opbevares i adskillige dage ved 4 ° C, men længere opbevaringstider øge risikoen for støbning. Mugne prøver kan ikke anvendes til DNA-fremstilling. Skyl rodprøver med vand for at fjerne jorden. Sætte dem i en steril petriskål og bruge en steriliseret skalpel for at fjerne de dybereliggende epidermis og cortex. Rengør skalpel med en ren, fnugfri væv tørre, dyppe den i 70% (v / v) ethanol vandopløsning, og varme-sterilisere det over åben ild (f.eks bunsenbrænder). Ridse phloem med skalpel, hak den i små stykker, og aliquot 30 – 100 mg af det hakkede phloem i en steril 2,0 ml reaktionsglas. Opbevare prøverne ved -80 ° C i flere måneder. Prøvetagning og forberedelse fra blade Identificer en inficeret og en asymptomatisk kontrol træ, ens beskrevet i trin 1.1.1.1, og plukke ti uskadt blade pr træ. Et træ pr betingelse er tilstrækkelig. Skyl bladene med vand og rense overfladerne ved sprøjtning 70% (v / v) ethanol-opløsning. Sætte bladene i en steril petriskål og dissekere midterribben (central vene) af hvert blad med en steril skalpel. Fjern epidermis og cortex fra midterribben, skæres midterribben i små stykker, og alikvot 100 mg midterribben væv i en steril 2,0 ml reaktionsglas. Brug prøverne straks til DNA-forberedelse eller opbevares ved -80 ° C i flere måneder. Bemærk: Det er praktisk at udportionerer plantematerialet i portioner på 100 mg og med tiden fryse dem til opbevaring. Hver aliquot kan anvendes direkte til DNA-fremstilling. Vejning dybfrosset plantemateriale er besværlig, eftersom det frosne plantemateriale tendens til at danne klumper. 2. cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) -baseret DNA-forberedelse <p class = "jove_content"> Bemærk: DNA kan oprenses ved hjælp af en kolonne-baserede DNA oprensning fremgangsmåde til plantemateriale. I dette afsnit beskrives en CTAB-baseret metode til DNA-oprensning. DNA oprensning udføres baseret på en modificeret protokol beskrevet andetsteds 32. Forbered følgende buffere: CTAB buffer: Opløs 1% vægt / volumen cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB, Mr: 364,45 g / mol), 100 mM trishydroxymethylaminomethan (Tris, Mr: 121,14 g / ml), 1,4 M natriumchlorid (NaCl, M r: 58,44 g / mol), og 20 mM ethylendiamintetraeddikesyredinatriumsalt (NaEDTA, Mr: 372,24 g / mol) i vand og justere dem til pH 8,0. N-lauroylsarcosin buffer: Opløs 10% vægt / volumen N-lauroylsarcosin-natriumsalt 33 (Mr: 293,38 g / mol), 100 mM Tris og 20 mM NaEDTA i vand og justere pH til 8,0. Tris-EDTA (TE) buffer: Opløs 10 mM Tris og 1 mM NaEDTA i vand og autoclave opløsningen. Ammoniumacetatopløsning: Der fremstilles en 5 M ammoniumacetat (Mr: 77,0825 g / mol) opløsning i vand og autoklaver den ved 120 ° C og 1,2 bar i 20 minutter. Bland 30 – 100 mg frisk eller frossen hakket plantemateriale (trin 1.1.2.2.) Med 300 pi CTAB buffer, 30 pi N-lauroylsarcosin puffer, 6 pi proteinase K (10 ug / pi), og 12 pi 2-mercaptoethanol 34 (Mr: 78,13 g / mol). Omrystes i 60 minutter ved 60 ° C. Lad blandingen køle af til stuetemperatur, før du fortsætter. Tilføj 360 uL af ammoniumacetatopløsning og bland kraftigt. Lad opløsningen sidde i 5 min, og derefter centrifugeres det ved 15.000 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten overføres til et rent hætteglas og tilsæt 720 pi iskold isopropanol 35. Udfælde DNA i mindst 30 minutter ved -20 ° C. Centrifugeres blandingen ved 15.000 xg i 30 minutter ved 4° C og kassér supernatanten. Vask pelleten med 500 pi iskold 70% ethanol og spinde det ned ved 15.000 xg i 5 min ved 4 ° C. Kassér ethanol supernatanten og straks dyppe hætteglasset på et rent stykke køkkenrulle for at fjerne resterende dråber. Sørg for at fjerne så meget væske som muligt. Lufttørres pelleten i 15-20 min eller i 2-3 min i en vakuumkoncentrator centrifuge. Må ikke over-tørre pellet ved overskydende opvarmning eller udvidede fordampning gange. Pellet resuspenderes i 700 pi TE-buffer og til sidst varme det op til 37 ° C for at lette opløsning. Der tilsættes 10 pi RNAse (10 ug / pi) og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C, under omrystning ved 300 rpm. Tilføj 700 pi chloroform: isoamylalkohol 36 24: 1 og bland godt. Centrifugeres blandingen ved 20.000 xg i 10 min ved 4 ° C og overføre den øvre fase af supernatanten overføres til et nyt, rent hætteglas. Udfælde DNA'et i supernatanten ved tilsætning700 pi 2-propanol 35 (isopropanol, M r: 60,1 g / mol) og inkubering i mindst 30 minutter ved -20 ° C. Centrifugeres blandingen ved 12.000 xg i 30 min ved 4 ° C og supernatanten. Vask pelleten med 500 pi 70% ethanol og centrifugeres ved 12.000 xg i 5 min ved 4 ° C. Tør pellet som beskrevet i trin 2.5. Opløs det i 50 uL TE. 3. Afsløring Kandidat fytoplasma mali-DNA ved PCR Fortynd DNA oprenset fra plantematerialet 1:10 i nuklease-frit vand og køre en PCR med patogen-specifikke primere 37. Kontrollere tilstedeværelsen af P. mali-specifik DNA i plantematerialet ved anvendelse af en kvantitativ PCR-protokol med primere og specifikke prober for P. mali fytoplasma 37. Check fravær af de andre 16SrX fytoplasma medlemmer ved at udføre den samme PCR med de respektive prober for CaND. P. prunorum og for Cand. P. pyri DNA 37. BEMÆRK: DNA fra en ikke-inficeret træ skal testes, samt at bekræfte fravær af et patogen i denne kontrol. På dette trin er det vigtigt, at DNA fra andre nært beslægtede fytoplasma arter er fraværende i prøven, da det ville øge risikoen for at forstærke effektoren fra en anden end P. mali fytoplasma arter. En blandet infektion med en anden nært beslægtet P. mali 16SrX gruppe fytoplasma er udelukket ved at analysere prøven med de respektive sonder. Da de forventede resultater skal være negative for andre 16SrX fytoplasma, er det vigtigt at medtage de rigtige positive kontroller, der angiver PCR effektivitet. 4. Amplifikation af potentialet Effector Gene og Subkloning ind i Y2H Bait Vector Amplificere phytoplasmal genet atp_00189 (ikke omfattende signalpeptidet del) af P. Mali anvendelse af primerne 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (fremad) og 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (revers), med restriktionssteder for EcoRI og Sall ved 5'- og 3'-enderne, henholdsvis. Oprense PCR-produktet med en kolonne-baserede DNA rensningsmetode. Klone amplikon i Y2H agn vektor pLexA-N via EcoRI og Sall ligering. BEMÆRK: Her 100 ng EcoRI og Sall lineariseret pLexA-N-vektoren blev kombineret med 15 ng af tilsvarende fordøjet atp_00189 PCR-amplikon og 1 U T4-ligase. Ligeringen blev udført i puffer indeholdende 40 mM Tris-HCI (pH 7,9 ved 25 ° C), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol (DTT, Mr: 154,25 g / mol) og 0,5 mM adenosintriphosphat (ATP, M r: 507,18 g / mol) i et samlet volumen på 10,0 pi ved 16 ° C natten over (14-20 timer). Analyser DNA fra ikke-inficerede træ med de samme primere for at udelukke uspecifik primer binding til Malus x domestica </Em> DNA. Transform 1 pi af ligeringsblandingen i E. coli elektrokompetente celler og selektere for kanamycinresistente kloner på Luria-Bertani (LB) plader suppleret med 50 ug / ml kanamycin sulfate 38. Oprens plasmid-DNA fra de udvalgte bakterielle kloner med en kolonne-baserede plasmid mini forberedelse kit ifølge producentens instruktioner, og kontrollere den vellykkede integration og orientering af insertet ved sekventering 39. 5. Test for Self-aktivering (Auto-aktivering) af de potentielle Effector Protein Forbered følgende puffere og vækstmedier: BEMÆRK: nomenklatur for gær-selektive plader hyphenates forkortelserne af de manglende aminosyrer i det respektive medie med et "-" før forkortelsen. For eksempel, SD-trp-Leu-hans plader indeholder alle aminosyrer, men trp, leu og hans. 10x frafald mix: Afvej200 mg L-arginin-monohydrochlorid (Mr: 210,66 g / mol), 300 mg L-isoleucin (Mr: 131,17 g / mol), 269 mg L-lysin-monohydrat (Mr: 164,21 g / mol), 200 mg L-methionin (M r: 149.21 g / mol), 500 mg L-phenylalanin (Mr: 165,19 g / mol), 2 g L-threonin (Mr: 119,12 g / mol), 300 mg af L-tyrosin (Mr: 181,19 g / mol), 200 mg L-uracil (112,09 g / mol) og 1,5 g L-valin (Mr: 117,15 g / mol). Opløse dem i 1 L dobbeltdestilleret vand og autoklaveres opløsningen. Opløsningen opbevares ved 4 ° C. BEMÆRK: respektive frafald mix kan være også købt færdigblandet. 10x L-adenin supplement: Afvej 100 mg L-adenin hemisulfatsalt (ade, Mr: 184,17 g / mol) og opløse den i 50 ml dobbelt-destilleret vand. Filtersteriliser opløsningen med et 0,22 um pore filter. 10x L-histidin supplement: Afvej 100 mg L-histidinmonohydrochloridmonohydrat (hans, Mr </sub>: 209,63 g / mol) i 50 ml dobbelt-destilleret vand og filter sterilisere det med en 0,22-um pore-filter. 10x L-leucin supplement: Afvej 500 mg L-leucin (leu, M r: 113,17 g / mol) i 50 ml dobbelt-destilleret vand og filtreres sterilisere det med en 0,22 um pore filter. 10x L-tryptophan supplement: Afvej 100 mg L-tryptophan (trp, Mr: 204,23 g / mol) i 50 ml dobbelt-destilleret vand og filtreres sterilisere det med en 0,22 um pore filter. SD-trp-leu-his-ade-medium og plader: Opløs 0,67% vægt / volumen gærnitrogenbase (uden aminosyrer) og 2% w / v D-glucose, monohydrat (Mr: 198,17 g / mol) i dobbelt- destilleret vand og autoklave. For agarplader, der tilsættes 2% w / v agar (mikrobiologisk kvalitet) før autoklavering. Til fremstilling selektive plader, tilsættes 1x af aminosyren stamopløsning til den autoklaveret Sd-trp-leu-his-ade medium. Ved udarbejdelsen plader, skal du sørge for, at agaren afkøles til ~ 50 ° C før tilsætningaminosyrerne. Hold stamopløsninger sterile. YPAD medium: Opløs 1% vægt / volumen gærekstrakt, 2% vægt / volumen pepton (mikrobiologisk kvalitet), 0,004% vægt / volumen adenin hemisulfatsalt (Mr: 184,17 g / mol) og 2% w / v glucose, monohydrat til dobbeltdestilleret vand og autoklaver. For YPAD agarplader, der tilsættes 2% w / v agar før autoklavering. For at forberede 2x YPAD, bruge dobbelt koncentrationerne af de ovennævnte ingredienser. Bemærk: (Valgfrit) På grund af den høje koncentration af glukose i mediet, 2x YPAD medium bliver mørk-brunlig efter autoklavering. Som et alternativ kan en 40% (w / v) glucose stamopløsning kan fremstilles og steriliseres ved passage gennem et 0,22 um filter. Den filtersteriliseret glucose stamopløsning tilsættes derefter til den autoklaveret 2x YPAD (mangler glucose) under sterile betingelser. For at undgå volumen fejl, skal 2x YPAD være forberedt, at holde for øje, at efterfølgende tilsættes en 10x glucoseopløsning. Det betyder, at for eksempel, i stedet for 1 L of medium, kun 900 ml fremstillet (indeholdende alle ingredienser undtagen glucose) og autoklaveres, og derefter tilsættes 100 ml af glucose stamopløsning. Lithiumacetat-medieret gær transformation til test selvaktivering Streak Saccharomyces cerevisiae reporter stamme NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2: :( LexAop) 4-HIS3 URA3: :( LexAop) 8-lacZ ade2: :( LexAop) 8-ADE2 GAL4) fra en frossen glycerolstamopløsning på en YPAD agarplade og inkuber det i 48 timer ved 30 ° C. Pick kolonier fra denne plade og pode 50 ml YPAD medium. Lad gær vokse og måle OD600 for regelmæssigt at overvåge væksten. Lad gæren vokse til en endelig OD600 på 0,5-0,8. Pelletere cellerne ved centrifugering dem ved 700 xg i 5 min og resuspenderes dem i 2,5 ml dobbelt-destilleret, autoklaveret vand. Forbered seks delprøver med 100 ul gærsuspension og tilsæt 240 pi af 50% W / v polyethylenglycol 4000 (PEG, Mr: 3,500-4,000 g / mol), 36 pi 1 M lithiumacetat-dihydrat (LiOAc, Mr: 102,02 g / mol), og 25 pi 2% vægt / volumen laksesperm DNA (opløst). Forbered alle reagenser med dobbelt-destilleret, sterilt vand. Mærke de seks hætteglas indeholdende gærsuspensionen fra "a" til "f" og tilføje følgende plasmidvektor DNA: negative kontroller: (a) 1,5 ug lokkemad plasmid med effektor (pLexA-N-atp00189 28), (b) 1,5 ug af tomme byttedyr plasmid pGAD-HA 41, (c) 1,5 ug tom agn vektor pLexA-N 41, og (d) 1,5 ug tom agn vektor pLexA-N og 1,5 ug af tomme byttedyr plasmid pGAD-HA; positive kontroller: (e) 1,5 pg af positiv-kontrol agn plasmid-DNA pLexA-p53 41 og 1,5 ug positiv-bytte plasmid pACT-indikativpris 41; og selv-aktivering test: (f) 1,5 ug badet plasmid med effektor (pLexA-N-atp00189) og 1,5 ug af tomme byttedyr plasmid pGAD-HA. Bland reaktionerne kraftigt og inkubere dem i 45 minutter ved 42 ° C i et vandbad. Pelletere cellerne i 5 minutter ved 700 xg og kassér supernatanten. Resuspender cellerne i 250 pi 0,9% (vægt / volumen) natriumchloridopløsning (NaCl, M r: 48.44 g / mol) og spredes 50 pi på følgende selektive plader: SD-Trp, Sd-Leu, SD-Trp- leu, SD-trp-leu-his, og SD-trp-leu-his-ade. Pladerne inkuberes i 3 – 4 dage ved 30 ° C. Efter den første dag i inkubation forsegle pladerne med plast paraffin film for at forhindre pladerne i at tørre ud. Kontroller gærvækst på pladerne. 6. Test Angivelse af Effector Test ekspressionen af effektor ved Western blot 42 med et antistof mod Lex-A tag, der er koblet ved N-terminalen af effektor nårudtrykt fra pLexA-N. Bemærk: Overvej at translationelt smeltet Lex-Et tag tilføjer omkring 24 kDa til den faktiske vægt af proteinet af interesse. Dette er vigtigt, når identificere proteinet størrelse i Western blot. 7. Y2H Screen Streak den pLexA-atp00189 (effektor) transformerede NMY51 på en frisk SD-trp plade og lade det vokse i 2 – 3 dage ved 30 ° C, indtil røde kolonier vises. Inokulere 3 ml SD-trp-medium i et lille rystekolbe med en rød koloni fra agarpladen og inkuberes natten over ved 30 ° C under omrystning 120 navne – 150 rpm. Pode 20 ml af SD-trp i en rystekolbe med 1 ml af natten over kultur og lade det vokse i 8 timer. Juster kulturen til OD600 = 0,2 ved tilsætning af SD-trp-medium og podning 2x 100 mL i rystning kolber med 10 ml af starterkulturen hver. Vokse natten under omrystning ved 30 ° C. Bemærk: Sørg for, at gæren ikke vokse til OD 600> 0,5 og fortyndes med frisk SD-trp. Mål OD 600 og pelleten 120 OD600 "enheder". For eksempel, hvis en OD 600 på 1,2 måles, spin ned 100 ml, kasseres supernatanten, og pellet resuspenderes i 800 ml forvarmet 2x YPAD i en rystekolbe med en magnetisk omrører. Spin ned en 2-ml portion, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i vand. Sørg for, at OD 600 af gær suspension er mellem 0,15 og 0,2. Hvis ikke, justeres med 2x YPAD eller tilføje flere gær fra overnight kultur. Bemærk: 2x YPAD er mørkebrun og kan påvirke resultaterne af OD-måling. Det er således nødvendigt at opblande gærcellerne i vand før bestemmelse af OD. Som et alternativ kan 2x YPAD fremstilles ved steriliserende glucose særskilt som beskrevet i trin 5.1.8 note, som forhindrer den mørke farve af mediet. Inkubér den resterende gær kultur i en appropriately dimensioneret rystekolbe (800 ml i en 2 liters rystekolbe eller dividere 2 x 400 ml i to 1 L rystekolber) og inkuber ved 30 ° C, 120 – 150 rpm. Mål OD 600 omkring hver 1,5 time, indtil en OD600 på 0,6 er nået (tager 4 – 6 timer). I mellemtiden forberede de løsninger, der er beskrevet i det næste trin. Lithiumacetat-medieret transformation Opløs 2% vægt / volumen laksesperma-DNA i vand og koges 500 pi i 5 minutter i et vandbad ved 100 ° C. Glasset anbringes på is i 2 minutter og gentag opvarmningstrinnet. Hold DNA på is indtil yderligere anvendelse. Forbered følgende blandinger: TE / LiOAc mix: Bland 3,08 ml 1 M LiOAc, 3,08 ml 100 mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5) og 21.84 mL sterilt, dobbeltdestilleret vand. PEG / LiOAc mix: Kombiner 4,2 ml 1 M LiOAc, 4,2 ml mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5), og 33,6 ml 50% (vægt / volumen) PEG 4000. Centrifuger 800-ml gærkultur (OD600 = 0,6)ved 700 xg i 5 min for at pelletere cellerne. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 ml sterilt dobbeltdestilleret vand. Pelletere cellerne igen ved 700 xg i 5 min og kassér supernatanten. Bemærk: Hvis det er nødvendigt kløft suspensionen i flere hætteglas for centrifugering. De flydende mængder i 7.7.3. og 7.7.4. henvise til hele pellet afledt af 800 ml suspension. Pellet resuspenderes i 16 ml TE / LiOAc mix (se trin 7.7.1.1); spin ned på 700 xg i 5 min og kassér supernatanten. Pellet resuspenderes i 9,6 ml TE / LiOAc mix. Forbered følgende reaktion blander i passende dimensionerede reaktion polypropylen fartøjer: 12 hætteglas med 7 ug pGAD-HA-cDNA-bibliotek vektor, 100 pi 2% laksesperma-DNA (se trin 7.7), og 2,5 ml af PEG / LiOAc mix. Tilføj 600 pi af gær cellesuspension fra trin 7,10 til hver af de 12 hætteglas og blandes kraftigt i 1 min. Inkubér reaktionsblandingen i 45 minutter ved 30 ° C i et vandbad end blande kraftigt hver 15 min. Tilføj 160 pi DMSO til hvert hætteglas og blandes kraftigt. Inkuber blandingen i yderligere 20 minutter ved 42 ° C. Pelletere cellerne ved 700 xg i 5 min, supernatanten, og resuspender hver pellet i 3 ml 2x YPAD. Pool alle celler (med i alt 36 ml fra 12 hætteglas) i en 100-ml rystekolbe og inkuberes gæren i 90 minutter ved 30 ° C og 120 rpm. Pelletere cellerne i 5 minutter ved 700 xg og kassér supernatanten. Pellet resuspenderes i 4,5 ml steril 0,9% (w / v) NaCl og bland godt ved omhyggeligt at pipettere op og ned med en 10-ml serologisk pipette. Udtag 50 pi og forberede tifold fortyndinger i 0,9% NaCl fra 1:10 op til 1: 1.000. Plade 100 pi af hver fortynding på 90 mm petriskåle indeholdende SD-trp-leu-agar. Fordel resten af ​​den ufortyndede gær resuspension den 16.- x 150 mm petri diameter retter med SD-trp-leu-his-ade agar. Tilsæt 3-AT til mediet for at reducere selv-aktivering. Inkubér SD-trp-leuplader til tre dage og SD-trp-leu-his-ADE plader til fire dage ved 30 ° C. BEMÆRK: Kloner, der vises på de selektive plader er (potentielle) interagerende par og bære pGAD-HA-plasmid koder for agn interagerende partner. Bestem transfektionseffektiviteten ved at tælle kolonier af de forskellige serielle fortyndinger på udvælgelsespladerne SD-trp-leu. Overfør hver klon ved at udvælge og udstryge koloni med en steril pipettespids af friske SD-trp-leu-his-ade-selektive plader. Pladerne inkuberes i 24 timer ved 30 ° C. Gentag dette trin hver dag, indtil i alt fem passager er nået. 8. Analyse af kloner fra Selektive plader Der forberedes en steril 2-ml reaktionsrør med 1 ml SD-trp-leu-his-ade for hver klon under en steril hætte. Punch et hul i hvert rør med en varm nål og dække hullet med et stykke gasgennemtrængeligt sealer. Podes hvert hætteglas med frisk koloni mate riale fra én klon (trin 7,17; bruge kloner efter det 5. passagen) og inkuberes i 24 timer ved 30 ° C, under omrystning ved 150 rpm. BEMÆRK: Det er vigtigt at tage kloner fra en frisk plade, fordi gær taget fra plader, der opbevares i adskillige dage ved 4 ° C ikke vokse tilstrækkeligt inden for 24 timer i flydende medium. Pelletere gær i 5 minutter ved 4.000 xg og kassér supernatanten. Pellet resuspenderes i et passende resuspension buffer (fra den respektive plasmid DNA miniprep kit), som overføres til et frisk 2,0 ml reaktionsglas. Tilsæt 100 pi af syrevasket glasperler (425- til 600-um diameter) og blandes kraftigt i 5 min. Tilsæt respektive lysepuffer og fortsæt med plasmidet oprensning under anvendelse af et plasmid præparat mini kit ifølge producentens anvisninger. Eluering af plasmid-DNA med 50 pi vand. Brug af DNA'et fra trin 8.3 for en sekventeringsreaktion med prey plasmid-specifik primer, GAL4ADseqref "> 41 5'ACCACTACAATGGATGATG -3". Kontroller samspillet med de novo co-transformere 43, 44 agn og bytte vektor. Vælg den transformerede gær på SD-trp-Leu-His-ade selektionsplader.