单细胞测序拷贝数改变的检测

1.单细胞分离准备microaspirator 拆下吸气管组件的透明塑料端插入窄端到1英尺长的PVC管的一端3/16“内径。 插入一个0.2微米的注射器过滤器的出口到1英尺长的PVC管的与3/6“内径的另一端。 插入0.2微米的注射器过滤器的入口与5/16“内径的6英寸长的PVC管的一端。 可选：切割5/16“内径的6英寸长的PVC管的一半，然后插入两半之间在自来水陷阱。 打破在1毫升刻度5毫升塑料血清吸管并插入断头插入PVC管的开放端与5/16“内径。 插入5毫升塑料血清吸管的出口进入吸气管组件的柔性端（那里的透明塑料端已被移除）。 对于存储，覆盖吸气管组件用无菌塑料管红色的喉舌。 通过使邻近本生灯火焰管的中间和在管的任一端施加张力抽出的玻璃毛细管的10-30微米的内径。打破拉制管中间创建两个潜在的抽吸针。重复此步骤，以几个管作为只有一些管将最终的内径是适当用于拾取单细胞。 对于存储，放置橡皮泥的两个带在15厘米的培养皿中，安全跨越条抽吸针。 挑选细胞准备以适合的细胞类型和实验的单个细胞悬浮液。例如，为了制备贴壁细胞如人成纤维细胞系，收获细胞通过胰蛋白酶消化和转移细胞到含有合适培养基的锥形管中。 之前，期间，或压脚提升准备单细胞悬液（取决于需要多长时间来准备单细胞悬液），设置了罩全基因组扩增。 喷向下罩，枪头盒，并用10％的漂白剂枪头的表面并用纸巾擦干。重复此步骤，以70％的乙醇。 从全基因组扩增（WGA）包到96孔PCR平板的各个孔中加水8微升，对于每个小区中的一个孔，以进行测序。覆盖从96孔组织培养板中，并置于冰上的盖的96孔PCR板。 添加1,000个细胞至10毫升介质或磷酸盐缓冲盐水（PBS）在15厘米的培养皿中，并将培养皿在冰上，以防止细胞附着在培养皿中。 带来在培养皿的细胞和96孔PCR平板在冰上盖用10X物镜光学显微镜。 轻轻拍打日的拉出端增加抽吸针的开口在坚硬的表面Ë抽吸针，使得尖折断。将抽吸针的宽端插入microaspirator的明确结束。 将包含在显微镜舞台细胞培养皿。放置在口腔中抽吸的红色吸嘴。用一只手来移动抽吸针和另​​一只手移动含有细胞培养皿。识别单个细胞待测序。 用口吸气，绘制一个单细胞到抽吸针头的媒体或PBS〜1-2μL一起。细胞转移到水的8微升的96孔PCR板的单个孔中。避免传输单元时产生气泡。 重复步骤1.2.7至细胞的期望数量的已被分离。保持冰的PCR板和采摘细胞间盖上盖子。标记已经接收的细胞的孔中。 虽然采摘单细胞，解冻从整体克10X单细胞裂解，破碎缓冲enome扩增试剂盒。拾取单元的期望数量后，立即进行全基因组扩增。 2.全基因组扩增为防止污染全基因组扩增过程中，加入组织培养罩内的所有试剂，用枪头有过滤器，并改变枪头井之间。 准备从全基因组扩增（WGA）工具包的工作裂解，破碎缓冲液。对于每一组多达32个细胞，结合32微升蛋白酶K溶液10倍的单细胞裂解和破碎缓冲液和2微升的微量离心管中。涡管混合的解决方案。 加入1微升的工作裂解和片段化缓冲液到每个孔中并吸取上下混合。 覆盖板和密封所有孔用塑料薄膜。短暂离心在迷你板微调板。 热周期FOLL流入：50℃，1小时，99℃，4分钟。 在冰上冷却板，短暂离心在迷你板微调板。 准备从全基因组扩增试剂盒工作文库制备缓冲溶液。对于每个小区，结合1个单细胞文库制备缓冲液2微升和在微量离心管文库稳定溶液1μL。准备几个小区在相同的离心管中的工作液。 除去塑料膜，并添加工作文库制备缓冲液到每个孔中的3微升。吸取井上下的内容混合。更换塑料薄膜。 注：塑料薄膜可以遍及全基因组扩增过程，直到井开始在膜中钻孔被重用。当这种情况发生时，切换到新的塑料膜。 短暂离心在微型板喷丝板，并在95℃下孵育2分钟。 冷却板置于冰上并简要离心机迷你板微调板。 除去塑料膜，添加1μL的文库制备酶至每个孔，并吸取井的内容上下混合。保持冰或经过该步骤感冒块库制剂酶。更换塑料薄膜。 短暂离心在微型板喷丝和热循环的板如下：16℃，20分钟，24℃，20分钟，37℃，20分钟，75℃，5分钟，并保持在4℃。 在冰上冷却板，短暂离心在迷你板微调板。 准备从全基因组扩增试剂盒工作扩增混合液。对于每个小区，结合4​​8.5微升水，7.5微升10X放大主混合物，并在离心管5微升的WGA DNA聚合酶。准备工作组合为几个小区在相同的离心管中。保持冰工作组合。 取下塑料薄膜，加入61 mL工作扩增混合液以良好上下各有好，吸管内容物混合。保持冰或经过该步骤感冒块工作扩增混合液。更换塑料薄膜。 短暂离心在微型板喷丝板和热循环如下：95℃，3分钟，94℃25个循环，30秒和65℃，5分钟，并保持在4℃。 转移60微升各样品到一个单独的离心管中并储存在 – 20℃下，在步骤3中使用。 DNA上样染料添加到每个样品（ 即 3 6×μL的DNA上样染料样品的15μL）的剩余量，并从在1％琼脂糖凝胶上各反应运行5微升。 注：成功扩增将显示为涂片从250到1000 bp的细胞。样品不显示一个涂抹或只显示一个微弱涂抹不大可能产生有用的测序数据。 3.测序净化与顺珠样品。 THA在冰上瓦特DNA样本。涡旋顺磁性珠粒直到溶液是均匀的孵育在室温下将珠粒至少30分钟。 转移每一个DNA样本的20微升到一个干净的离心管中。该样品的其余部分可被储存在-20℃。 添加的顺磁珠30μL（1.5倍），以每一个DNA样本，涡旋混合。在室温下孵育样品10分钟。留在室温下，在步骤3.4的珠的原液使用。 放置在磁管条管2分钟，或直到珠粒形成沉淀，上清液是明确的。 使用P200移液器，去掉尽可能多上清尽可能不干扰珠。 添加80％乙醇180微升的DNA珠混合物。旋转管相对于所述磁体通过乙醇溶液“冲洗”珠数次。 使用P200移液器，去掉尽可能多的乙醇洗为possi的竹叶提取不干扰珠子。 重复3.1.6和3.1.7。 空气干燥该珠为约10分钟，或直到没有更多的乙醇是可见的。继续进行到下一步骤时，珠出现破裂或脱落管的壁。 从磁条取出样品。添加10毫摩尔Tris pH 8.0的40微升洗脱从珠的DNA和涡样品重悬珠子。孵育在室温下2分钟。 短暂离心样品以收集在试管底部的液体，然后将管上的磁性管条用于至少两个分钟。转移洗脱液成清洁离心管，而不会干扰珠。 样品正常化定量使用分光光度计每个样品的浓度。浓度应为10至30毫微克/微升。 每个样品稀释至0.2纳克/μL使用10毫米的Tris pH值8.0。下面的步骤将需要最少我从这种稀释5微升NPUT。 图书馆准备由以下的文库制备试剂盒13的说明准备测序文库。 最后的清理根据步骤3.1清洗样品。对于50个基点，75基点，或150基点的读长，使用珠的比例分别为1.5倍采样，1个或0.6倍的量。用10mM的Tris pH为8.0的15微升洗脱。 上运行的片段分析器样本以检查库14的粒度分布。粒度分布应均匀地分布从150至900基点。 量化使用qPCR样品使用库定量试剂盒，根据试剂盒的说明15设置了定量PCR反应。留下一个空白栏添加正的标准（从工具包DNA标准）和负标准（水或其他空白溶液）。 热周期FOL低点：95℃，5分钟（4.8℃/秒的升温速度），并在95℃，30秒（4.8℃/秒的斜升速率）和60℃，45秒（2.5爬坡速率35次循环℃/秒）。 池确定如何，还需要在流动池很多小巷和划分样本分成组，每个通道一组。 对于每一个样品组，选择与基于从步骤3.5.2的qPCR数据的最低浓度的样品和该组中的正常化所有样品使用的10mM Tris pH 8.0的浓度。 池中的每个组中的样本。 测序按照标准程序16新一代测序机上载池。 4.数据分析注：基于Unix的环境下才能运行本节中的程序和脚本。安装其在下面的协议中提到的软件 stallation指南。所有的脚本可以在https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/找到。 修剪读取使用fastx_trimmer从FASTX-工具包版本0.0.13 17 40-NT。 fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq 对准读取使用BWA版0.6.1使用默认选项18适当的参考基因组（MM9鼠标，hg19人类）。 BWA的AlN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai BWA samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam 删除对齐到CHRM和随机染色体，然后进行排序，并使用SAMTools版本0.1.19 19指数产生的BAM文件。 grep的-v -w CHRM example.sam | grep的-v随机> example.filtered.sam samtools查看-uSh example.filtered.sam | samtools排序 – example.filtered samtools指数example.filtered.bam 运行HMMcopy检测拷贝数变异=“外部参照”> 20 使用gcCounter在HMMcopy产生用于基因组中的GC百分比参考文件。使用选项“-w 500000”来指定窗口的大小。使用步骤4.2中使用的FASTA参考文件的版本相同，但要确保CHRM和随机染色体从FASTA文件中删除。 gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig 使用generateMap.pl在HMMcopy生成mappability一个摆动文件。使用选项“-w 40”指定阅读的长度。使用步骤4.4.1使用的相同的fasta参考文件。 generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig 使用mapCounter在HMMcopy产生用于基因组中的mappability参考文件。使用选项“-w 500000”来指定窗口的大小。 mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig 使用readCounter在HMMcopy生成每个BAM文件蠕动文件。 readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig </l我> 修改在R脚本路径参考文件（run_hmmcopy.mm9.r或run_hmmcopy.hg19.r），使用4.4.1（ 如 mm9_gc.wig）和4.4.3（ 如上面mm9_map生成的文件。假发）为变量GFILE和MFILE，其分别是指由GC百分比参考文件和mappability参考文件。然后运行提供ř剧本“run_hmmcopy.mm9.r”或“run_hmmcopy.hg19.r”。 – [R CMD批run_hmmcopy.mm9.r 要么 – [R CMD批run_hmmcopy.hg19.r 一组BAM文件的批处理，把BAM文件在一个文件夹中，并运行提供的脚本“HMMpipe.pl”在包中调用段和计算变异的分数（VS）。按照格式： perl的HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9 运行DNAcopy检测CNV的21。 使用SAMtools版本0.1.19中提取唯一映射每个BAM文件读取。 samtools查看-h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep的-i“^ @ | XT：A：U”| samtools查看姝达 – > example.mapped.bam 使用皮卡德版本1.94 MarkDuplicates，以纪念在BAM PCR重复文件22。 Java的罐子MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam输出= example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES =真在bedtools版本2.17.0来计算映射使用coveragebed读取所提供的床档“mm9.500k.dynamic.win.bed”或“hg19.500k.dynamic.win.bed”23每个预定义的动态500KB可映射窗口。 coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -COUNTS |排序-k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts 使用所提供的Perl脚本“normalizeGC.pl”正常化基于所提供的GC含量的参考文件“mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt”或“hg19.500k.dynamic.win.fa读计数。 gc.txt“。 perl的normalizeGC。PL mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts 使用所提供的脚本 – [R“dnacopy.r”来称呼段。 – [R CMD批dnacopy.r 确定拷贝数变异排除这在4.4.6计算VS超过0.26细胞。 筛选4.4.6通过HMMcopy称为段只包括那些的量，中位数日志2比大于0.4（推定的增益）或小于-0.35（推定的损失）。 筛选由4.5.5叫DNAcopy段，只包括那些该段的意思是小于0.6大于1.32。 从4.6.2和4.6.3重叠部分，只有在地区其中两个HMMcopy和DNAcopy确定一个假定的利得或损失假定调用拷贝数变异。