Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

1. Изолировать отдельные клетки Подготовьте microaspirator Снимите прозрачную пластиковую конец от узла аспиратор трубки и вставьте узкий конец в один конец 1 футов длиной ПВХ трубы с 3/16 "внутреннего диаметра. Вставьте выходное отверстие шприцевой фильтр 0,2 мкм в другом конце 1 футов длиной ПВХ трубки с 3/6 "с внутренним диаметром. Вставьте впуск шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм в один конец 6 дюймов длиной ПВХ трубки с 5/16 "внутренним диаметром. Дополнительно: Разрежьте 6 дюймов длиной ПВХ трубы с 5/16 "внутренним диаметром пополам и вставить в линию ловушку воды между двумя половинами. Перерыв 5 мл пластмассовую серологической пипеткой на мл градации 1 и вставьте конец шнура в открытый конец трубки из ПВХ с 5/16 "внутреннего диаметра. Вставьте выпускное отверстие 5 мл пластиковой серологической пипеткой в ​​гибкий конец сборки аспиратор трубки (где прозрачный пластиковый конецбыли удалены). Для хранения, накрыть красную мундштук узла аспиратор трубки со стерильной пластиковой трубкой. Почерпните стеклянной капиллярной трубки с внутренним диаметром 10-30 мкм, путем приведения в середину трубки вблизи пламени горелки Бунзена и прикладывать напряжение на обоих концах трубки. Разбейте нарисованный трубку в середине, чтобы создать два потенциальных иглы аспиратора. Повторите этот шаг с несколькими трубками, как только некоторые трубы будут в конечном итоге с внутренним диаметром, который подходит для получения отдельных клеток. Для хранения, поместите две полоски пластилина в 15 см чашку Петри и закрепить иглы аспиратора поперек полос. Выберите клетки Подготовка суспензии отдельных клеток в зависимости от обстоятельств для типа клеток и эксперимента. Например, чтобы подготовить прилипшие клетки, такие как линии человеческих фибробластов, урожай клеток с помощью обработки трипсином и переноса клеток в коническую пробирку, содержащую соответствующий носитель. До, во время, илиосле получения одноклеточной суспензии (в зависимости от того, сколько времени потребуется, чтобы подготовить одноклеточной суспензии), установки капотом для всего генома амплификации. Спрей вниз поверхность капота, наконечник пипетки коробки и пипеток с 10% хлорной и протереть бумажным полотенцем. Повторите этот шаг с 70% этанола. Добавить 8 мкл воды из Амплификация полного генома (WGA) набор для отдельные лунки 96-луночного ПЦР планшета, один хорошо для каждой ячейки, чтобы быть секвенированы. Накройте 96-луночного ПЦР планшета с крышкой из пластины для тканевой культуры в 96-луночный и место на льду. Добавьте 1000 клеток в 10 мл среды или фосфатном буферном растворе (PBS) в 15 см чашки Петри и помещают блюдо на льду, чтобы предотвратить клетки от присоединения к чашке. Доведите клетки в чашке Петри и 96-луночного ПЦР планшета с крышкой на льду к световым микроскопом с целью 10X. Увеличение открытие аспиратора иглы, осторожно коснувшись вытянутый конец йе аспиратор иглы на твердую поверхность таким образом, чтобы кончик отламывается. Вставьте широкий конец аспиратора иглы в чистую конце microaspirator. Поместите чашку Петри, содержащую клетки на стадии микроскопа. Поместите красный мундштук аспиратора во рту. Используйте одну руку, чтобы переместить аспиратор иглу и, с другой стороны, чтобы переместить чашку Петри, содержащую клетки. Определить отдельные клетки, подлежащие секвенированию. Использование всасывания рот, нарисуйте одну ячейку в аспиратор иглу вместе с ~ 1-2 мкл среды или PBS. Перенести клетки в 8 мкл воды внутри одной лунке 96-луночного планшета для ПЦР. Избегайте введения пузырьков при переносе клетки. Повторите шаг 1.2.7, пока нужное количество клеток не были изолированы. Держите пластину ПЦР на льду и покрыта крышкой между собирание клетками. Отметьте скважины, которые получили клетки. Хотя выбирая отдельные клетки, растопить 10X одного лизис клеток и фрагментации буфера от целого гenome амплификации комплект. После выбора нужного количества клеток, немедленно приступить к амплификации целого генома. 2. Амплификация полного генома Для предотвращения загрязнения в течение всего генома амплификации, добавить все реагенты внутри капот культуре ткани, используйте пипеток с фильтрами, а также изменить кончик пипетки между скважинами. Подготовка рабочего раствора для лизиса и фрагментации буфера из комплекта Амплификация полного генома (WGA). Для каждого набора до 32 ячеек, объединить 32 мкл 10х одного лизиса клеток и фрагментации буфера и 2 мкл раствора протеиназы К в микроцентрифужных трубки. Vortex трубку для смешивания растворов. Добавить 1 мкл рабочего лизиса и фрагментации буферного раствора в каждую лунку и пипетку вверх и вниз, перемешать. Закройте планшет и запечатать все лунки с пластиковой пленкой. Кратко центрифуге пластину в мини-пластины блесны. Термический цикл, как ФолляРМО: 50 ° С, 1 ч и 99 ° С, 4 мин. Охлаждают пластину на льду и кратко центрифуге пластину в мини-пластины блесны. Подготовьте рабочую библиотеку буферного раствора препарата из набора генома амплификации целого. Для каждой ячейки, объединить 2 мкл 1x одной библиотеки ячейки буфера подготовки и 1 мкл библиотеки раствора стабилизации в микроцентрифужных трубки. Подготовка рабочего раствора для нескольких ячеек в той же самой трубки микроцентрифужных. Удалите пластиковую пленку и добавьте 3 мкл рабочей библиотеки буферного раствора препарата в каждую лунку. Пипетировать содержимое скважины вверх и вниз, перемешать. Замените пластиковую пленку. Примечание: Пластиковая пленка может быть повторно использована в течение всего процесса амплификации генома, пока лунки не начнут бурить отверстия в пленке. Когда это происходит, переключиться на новую пластиковую пленку. Кратко центрифугировать пластины в мини-пластины обтекателя втулки и инкубировать при 95 ° С в течение 2 мин. Охлаждают пластину на льду и краткоцентрифугировать пластину в мини пластины блесны. Удалите пластиковую пленку, добавить 1 мкл библиотеки Ферментный препарат в каждую лунку, и пипеткой содержимое скважины вверх и вниз, перемешать. Держите библиотеку фермента подготовки на льду или в холодном блоке на протяжении всего этого шага. Замените пластиковую пленку. Кратко центрифугировать пластину в мини-пластины обтекателя втулки и термического цикла следующим образом: 16 ° C, 20 мин, 24 ° C, 20 мин, 37 ° С, 20 мин, 75 ° С, 5 мин, и держать при температуре 4 ° С. Охлаждают пластину на льду и кратко центрифуге пластину в мини-пластины блесны. Подготовить рабочую смесь из амплификации набора генома амплификации целого. Для каждой ячейки, объединить 48,5 мкл воды, 7,5 мкл 10х усиления основной смеси и 5 мкл WGA ДНК-полимеразы в микроцентрифужных трубки. Подготовка рабочей смеси для нескольких ячеек в той же самой трубки микроцентрифужных. Держите рабочую смесь на льду. Удалите пластиковую пленку, добавить 61 мкл рабочего амплификации смесив каждую лунку и содержание пипетка также вверх и вниз, перемешать. Держите рабочую смесь амплификации на льду или в холодном блоке на протяжении всего этого шага. Замените пластиковую пленку. Кратко центрифугировать пластины в мини-пластины обтекателя втулки и термического цикла следующим образом: 95 ° С, 3 мин, 25 циклов при 94 ° С, 30 сек и 65 ° С, 5 мин, и держать при температуре 4 ° С. Передача 60 мкл каждого образца в отдельную пробирку микроцентрифужных и хранить при – 20 ° C для использования на стадии 3. Добавить загрузки ДНК красителя оставшегося объема каждого образца (то есть 3 мкл ДНК – 6х красителем до 15 мкл образца) и пробегать по 5 мкл от каждой реакции на агарозном геле 1%. Примечание: Клетки, которые успешно Усиленные будет выглядеть как мазок от 250 до 1000 пар оснований. Образцы, которые не показывают мазок или только показывают слабый мазок вряд ли даст полезные данные секвенирования. 3. Секвенирование Очищают образцы с парамагнитными гранулами. ThaW образцы ДНК на льду. Vortex парамагнитные шарики до тех пор, пока раствор не станет однородным и инкубировать бусинки при комнатной температуре в течение не менее 30 мин. Перенесите 20 мкл каждого образца ДНК в чистую центрифужную пробирку. Остальная часть образца можно хранить при -20 ° С. Добавить 30 мкл (1.5x) парамагнитных шариков для каждого образца ДНК и вихря перемешать. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин. Оставьте маточный раствор гранул при комнатной температуре для использования на стадии 3.4. Место труб на полоске магнитной трубки в течение 2 мин, или до тех пор, пока гранулы образуют осадок и надосадочную жидкость ясна. Использование P200 пипетки, удалить как можно больше супернатанта, насколько это возможно, не нарушая бусинки. Добавьте 180 мкл 80% этанола к ДНК-бусинка смеси. Поворот в трубки несколько раз по отношению к магниту, чтобы "прополоскать" бусинки через раствор этанола. Использование P200 пипетки, удалить как можно больше стирке этанола в качестве возможBLE, не нарушая бусинки. Повторить 3.1.6 и 3.1.7. Воздух сухой шарики в течение приблизительно 10 минут или пока не больше этанола не видно. Перейдите к следующему шагу, когда шарики появляются трещины или отвалиться стенки трубы. Удалить образцы с магнитной полосы. Добавить 40 мкл 10 мМ Трис, рН 8,0 до элюции ДНК из гранул и вихревые образцы для ресуспендирования бусин. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре. Кратко Центрифуга образцов для сбора жидкости в нижней части трубы и поместить пробирки на полосу магнитной трубки в течение не менее двух минут. Передача элюента в чистые микропробирок, не нарушая бусинки. Пример нормализации Вычислить концентрацию каждого образца с использованием спектрофотометра. Концентрации должен находиться в диапазоне от 10 до 30 нг / мкл. Развести каждый образец до 0,2 нг / мкл с использованием 10 мМ Трис рН 8,0. Следующие шаги потребуют минимального INput 5 мкл из этого раствора. подготовка Библиотека Подготовка библиотек секвенирования, следуя инструкциям подготовки комплекта 13 библиотеки. Заключительная уборка Очистите образцы в соответствии с этапом 3.1. Для считывания длиной 50 б.п., 75 б.п., или 150 б.п., использовать соотношение шарика к образцу объема 1.5x, 1x или 0.6x, соответственно. Элюировать 15 мкл 10 мМ Трис, рН 8,0. Запуск образцов на анализаторе фрагмента , чтобы проверить распределение размера библиотеки 14. Распределение по размерам должна быть равномерно распределена от 150 до 900 пар оснований. Количественно образцов с использованием КПЦР Использование библиотеки набора квантификации, настроить реакцию КПЦР согласно инструкции к набору 15. Оставьте столбец пустым, чтобы добавить положительные стандарты (стандарты ДНК из набора) и отрицательные стандарты (воды или другого раствора бланка). Термический цикл, как ВОЛПминимумы: 95 ° C, 5 мин (градиент скорости от 4,8 ° С / сек) и 35 циклов при 95 ° С, 30 сек (градиент скорости 4,8 ° С / с) и 60 ° С, 45 сек (градиент скорости 2,5 ° С / сек). объединение Определите, как требуется много полос на проточной ячейке и разделить образцы на группы, с одной группой на дорожку. Для каждой группы образцов, выбрать образец с самой низкой концентрацией, основываясь на данных КПЦР с этапа 3.5.2 и нормализовать все образцы в этой группе к этой концентрации с использованием 10 мМ Трис рН 8,0. Объединяют образцы в каждой группе вместе. Последовательность действий Нагрузка на бассейны секвенирования машины следующего поколения в соответствии со стандартными процедурами 16. Анализ 4. Данные Примечание: Среда Unix на основе требуется для запуска программ и скриптов в этом разделе. Установите программное обеспечение, указанное в протоколе после их в систему трализованную установку направляющих. Все сценарии можно найти на сайте https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/. Обрежьте читает 40-нт с использованием fastx_trimmer из FASTX-Toolkit версии 0.0.13 17. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq Совместите читает соответствующий референсный геном (ММ9 для мыши, hg19 для человека) с использованием BWA версии 0.6.1 с параметрами по умолчанию 18. BWA AlN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai BWA samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam Удалить выравнивания для CHRM и случайных хромосом, а затем сортировать и индекс полученный BAM файл , используя SAMTools версию 0.1.19 19. Grep -v -w CHRM example.sam | ГРЭП -v случайное> example.filtered.sam samtools просмотра -uSh example.filtered.sam | samtools сортировать – example.filtered samtools индекс example.filtered.bam Запуск HMMcopy для обнаружения ВКК= "Xref"> 20 Используйте gcCounter в HMMcopy, чтобы создать ссылочный файл процент GC для генома. Используйте опцию "-w 500000", чтобы указать размер окна. Используйте ту же версию эталонного FASTA файла, используемого на стадии 4.2, но убедитесь, что CHRM и случайные хромосомы удалены из файла Fasta. gcCounter -w +500000 mm9.fa> mm9_gc.wig Используйте generateMap.pl в HMMcopy для создания файла покачивания для mappability. Используйте опцию "-w 40", чтобы указать длину чтения. Используйте тот же опорный FASTA файл, используемый на этапе 4.4.1. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig Используйте mapCounter в HMMcopy, чтобы создать ссылочный файл mappability для генома. Используйте опцию "-w 500000", чтобы указать размер окна. mapCounter -w +500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig Используйте readCounter в HMMcopy для создания файла покачивания для каждого файла БАМ. readCounter -w +500000 example.filtered.bam> input.wig </lя> Изменение пути к файлам в справочных сценариях R (run_hmmcopy.mm9.r или run_hmmcopy.hg19.r), используйте файлы , созданные выше в 4.4.1 (например, mm9_gc.wig) и 4.4.3 (например, mm9_map. парик) для gfile и MFile переменных, которые относятся к файлу процент GC ссылка файла и эталонной mappability соответственно. Затем запустите предоставленный сценарий R "run_hmmcopy.mm9.r" или "run_hmmcopy.hg19.r". R CMD BATCH run_hmmcopy.mm9.r или R CMD BATCH run_hmmcopy.hg19.r Для пакетной обработки набора BAM файлов, поместить файлы БАМ в одну папку и запустите предоставленный сценарий "HMMpipe.pl" в пакете для вызова сегментов и вычислить изменчивость оценок (VS). Следуйте формату: Perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9 Запуск DNAcopy для обнаружения ВКК 21. Используйте SAMtools версию 0.1.19 для извлечения однозначно сопоставляются считывает из каждого файла БАМ. samtools просмотра -h -F 0x0004 example.filtered.bam | -i задать расширенное "^ @ | XT: A: U" | samtools смотреть -Shu -> example.mapped.bam Используйте MarkDuplicates в Picard версии 1.94 , чтобы отметить ПЦР дубликатов в БАМ файл 22. Java -jar MarkDuplicates.jar ВХОД = example.mapped.bam ВЫХОД = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = верно Используйте coveragebed в bedtools версии 2.17.0 для подсчета отображенных читает в каждом из предопределенных динамического 500kb отображаемыми окна в файл BED при условии "mm9.500k.dynamic.win.bed" или "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 , coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | сортировать -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts Используйте прилагаемый Perl скрипт "normalizeGC.pl" нормализовать счетчики чтения на основе при условии, ссылка файлов содержания GC "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" или "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ". Perl normalizeGC.пл mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts Используйте прилагаемый R скрипт "dnacopy.r" для вызова сегментов. R CMD BATCH dnacopy.r Определение ВКК Исключить клетки, для которых VS рассчитывается в 4.4.6 превышает 0,26. Фильтр сегментов , вызываемые HMMcopy в 4.4.6 , чтобы включить только те , для которых средний логарифм отношения 2 больше , чем 0,4 (предполагаемый коэффициент усиления) или менее -0,35 (предполагаемая потеря). Фильтр сегментов, вызываемые DNAcopy в 4.5.5, чтобы включить только те, для которых отрезок означают больше, чем 1,32 или менее 0,6. Перекрытие сегментов из 4.6.2 и 4.6.3, вызывая ВКК только в тех регионах, где оба HMMcopy и DNAcopy идентифицируют предполагаемую прибыль или предполагаемую потерю.