単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

1.単一細胞を単離します microaspiratorを準備吸引管アセンブリから透明なプラスチックの端を削除し、3月16日「内径1フィート長PVCチューブの一方の端部に狭い方の端を挿入します。 3/6 "内径1フィート長PVCチューブのもう一方の端に0.2μmシリンジフィルターの出口を挿入します。 5/16 "内径6インチの長さのPVC管の一端に0.2μmシリンジフィルタの入口に挿入します。 オプション：半分に5/16 "内径6インチの長さのPVCチューブをカットし、二つの半分の間のインライン水トラップを挿入します。 1 mLの目盛りで5 mLのプラスチック血清学的ピペットを破ると5/16 "内径PVC管の開放端に切断端を挿入します。 吸引管アセンブリの柔軟なエンド（透明なプラスチックの端に5 mLのプラスチック血清学的ピペットの出口を挿入します）は削除されていました。 ストレージについては、滅菌プラスチックチューブで吸引管アセンブリの赤いマウスピースをカバーしています。 ブンゼンバーナーの炎の近くに管の中央をもたらし、チューブの両端に張力を印加することにより、10〜30ミクロンの内径にガラス毛細管を引き出します。 2潜在的な吸引針を作成するために、中央に描かれたチューブを破ります。唯一のいくつかのチューブが単一細胞をピッキングに適した内径で終わるように、いくつかのチューブと、この手順を繰り返します。 ストレージについては、15センチメートルペトリ皿にモデリング粘土の2つのストリップを配置し、ストリップを横切って吸引針を固定します。 セルを選択してください細胞の種類や実験のための適切な単一細胞懸濁液を準備します。例えば、適切な培地を含むコニカルチューブにトリプシン処理および転送細胞によるヒト線維芽細胞株、収穫細胞と接着細胞を調製しました。 前、中、またはA単一細胞懸濁液（これは、単一細胞懸濁液を調製するのにかかる時間の長さに応じて）、セットアップ全ゲノム増幅のためのフードを準備FTER。 10％の漂白剤でフード、ピペットチップボックス、およびピペットチップの表面を下にスプレーし、紙タオルで拭いてください。 70％エタノールで、この手順を繰り返します。 配列決定される各セルに対して1つのウェル、全ゲノム増幅（WGA）キットの96ウェルPCRプレートの個々のウェルに水の8μLを追加します。氷上で96ウェル組織培養プレートと場所の蓋付き96ウェルPCRプレートを覆います。 15 cmのペトリ皿に10mlの培地またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に1,000細胞を追加し、皿に付着した細胞を防ぐために、氷の上皿を置きます。 10X対物レンズの光顕微鏡に氷の上で蓋をペトリ皿内の細胞と96ウェルPCRプレートを持参してください。 そっと目の引き出された端をタップしてアスピレータ針の開口部を増やします硬い表面上の電子吸引器の針は、先端が途切れるようになっています。 microaspiratorの明確な端部に吸引針の広い方の端を差し込みます。 顕微鏡ステージ上の細胞を含むペトリ皿を置きます。口の中に吸引器の赤いマウスピースを置きます。細胞を含有するペトリ皿を移動するために吸引針ともう一方の手を移動するために片手を使用してください。配列決定される単一細胞を識別します。 口の吸引を使用して、メディアまたはPBSの〜1-2μLと一緒に吸引針に1つのセルを描画します。 96ウェルPCRプレートの1ウェル内の水の8μLに細胞を転送します。セルを転送する際に気泡を導入することは避けてください。 細胞の所望の数が単離されているまで、ステップ1.2.7を繰り返します。氷上でPCRプレートを保持し、ピッキング細胞との間で蓋をし。細胞を受けた井戸をマークします。 単一細胞を採取しながら、全体のGから10X単一細胞溶解および断片化緩衝液を解凍enome増幅キット。細胞の所望の数をピッキングした後、全ゲノム増幅にすぐに進んでください。 2.全ゲノム増幅 、全ゲノム増幅中の汚染を防止するための組織培養フード内のすべての試薬を追加し、フィルターをピペットチップを使用し、ウェル間にピペットチップを変更します。 全ゲノム増幅（WGA）キットから作業を溶解および断片化緩衝液を準備します。最大32セルの各セットについて、マイクロチューブにプロテイナーゼK溶液の10倍単一細胞溶解および断片化緩衝液および2μLの32μLを兼ね備えています。溶液を混合し、チューブをボルテックスし。 作業を各ウェルに溶解および断片化緩衝液およびピペットアップの1μLを加え、ミックスダウンします。 プレートをカバーし、プラスチックフィルムで全てのウェルを密閉します。簡単に言えば、ミニプレートスピナーでプレートを遠心します。 follとして熱サイクルOWS：50°C、1時間および99℃、4分。 氷の上でプレートを冷却し、簡潔にミニプレートスピナーでプレートを遠心分離します。 全ゲノム増幅キットから作業ライブラリー調製緩衝液を準備します。各セルについて、1xシングルセルライブラリ調製緩衝液とマイクロチューブ内のライブラリ安定化溶液の1μLの2μLを兼ね備えています。同じマイクロ遠心チューブ内の複数のセルのための作業溶液を準備します。 プラスチックフィルムを取り外し、各ウェルに、ライブラリの準備緩衝液を作業の3μLを追加します。混合するだけでなく、上下の内容をピペット。プラスチックフィルムを交換してください。 注意：ウェル膜のボア孔を開始するまで、プラスチックフィルムは、全ゲノム増幅プロセスを通じて再利用することができます。これが発生すると、新しいプラスチックフィルムに切り替えます。 簡単に言えば、ミニプレートスピナーでプレートを遠心分離し、95℃で2分間インキュベートします。 氷と簡単にプレートを冷却ミニプレートスピナーでプレートを遠心します。 プラスチックフィルムを取り外し、各ウェルにライブラリ準備酵素1μLを追加し、混合するだけでなく、上下の内容をピペット。このステップ全体で氷の上またはコールドブロック内のライブラリの準備酵素を保管してください。プラスチックフィルムを交換してください。 16°C、20分間、24°C、20分間、37°C​​、20分間、75℃、5分間、4℃で保持する。簡単に説明すると次のようにミニプレートスピナー及び熱サイクルでプレートを遠心分離します。 氷の上でプレートを冷却し、簡潔にミニプレートスピナーでプレートを遠心分離します。 全ゲノム増幅キットからの作動増幅ミックスを調製します。各セルについて、48.5μLの水、7.5μL10倍増幅マスターミックス、およびマイクロ遠心チューブ中5μLWGA DNAポリメラーゼを兼ね備えています。同じマイクロ遠心チューブ内のいくつかのセルのために働いてミックスを調製します。氷の上で作業のミックスをしてください。 プラスチックフィルムを外し、増幅混合物を作業61μLを追加よく上下との各ウェル、およびピペットの内容に混合します。氷の上またはこのステップを通して冷たいブロックで働く増幅混合物を保管してください。プラスチックフィルムを交換してください。 95℃、3分、94°Cの25サイクル、30秒、65℃、5分間、4℃で保持する：簡単に言うと次のようにミニプレートスピナー内プレートと熱サイクルを遠心分離します。 別々のマイクロ遠心チューブや店舗で、各サンプルの60μLを移し – 20°Cステップ3で使用するために。 各サンプル（サンプルの15μLにすなわち 3μL6倍のDNAローディング色素）の残り容量にDNAローディング色素を追加し、1％アガロースゲル上の各反応から5μLを実行します。 注：正常に増幅された細胞は、250〜1,000塩基対からスメアとして表示されます。スミアを表示したり、かすかなスメアを示していないサンプルは、有用な配列決定データを得にくいです。 3.シーケンシング常磁性ビーズでサンプルを精製します。 ター氷上のワットDNAサンプル。渦常磁性ビーズ溶液が均質であり、少なくとも30分間室温でビーズをインキュベートするまで。 きれいな微量遠心チューブに各DNAサンプルの20μLを転送します。サンプルの残りは-20℃で保存することができます。 各DNAサンプルと混合する渦に常磁性ビーズの30μL（1.5倍）を追加します。 10分間、室温でサンプルをインキュベートします。ステップ3.4で使用するために、室温でビーズの原液のままにしておきます。 2分間の磁性体管ストリップ上にチューブを置き、またはビーズは、ペレットを形成し、上澄み液が透明になるまで。 P200のピペットを用いて、ビーズを乱すことなく、可能な限り上清をできるだけ多く除去します。 DNA-ビーズ混合物に80％エタノールを180μLを追加します。エタノール溶液を介してビーズを「すすぎ」にチューブを磁石に比べて数回回転させます。 P200のピペットを用いて、possiとしてエタノール洗浄の限りを削除ビーズを乱すことなくBLE。 3.1.6と3.1.7を繰り返します。 空気は約10分間、またはそれ以上のエタノールが見えなくなるまでビーズを乾燥させます。ビーズが割れ現れたり、チューブの壁から落ち、次のステップに進みます。 磁気ストライプからサンプルを削除します。ビーズからDNAを溶出し、ビーズを再懸濁したサンプルをボルテックスする10 mMトリスpHが8.0の40μLを追加します。室温で2分間インキュベートします。 簡潔には、チューブの底に液体を収集し、少なくとも二つ分間磁気チューブストリップにチューブを配置するために、サンプルを遠心します。ビーズを乱すことなく、きれいな微量遠心チューブに溶出液を移します。 サンプルの正規化分光光度計を用いて、各試料の濃度を定量します。濃度は10から30 ngの/μLの範囲であるべきです。 10 mMトリスpHは8.0を使用して、0.2 ngの/μLに、各試料を希釈します。次の手順は、最小私を必要としますこの希釈液から5μLのNPUT。 ライブラリの準備ライブラリー作製キット13の指示に従ってシーケンシングライブラリを準備します。 最終的なクリーンアップステップ3.1に従ってサンプルを清掃してください。 50塩基対、75塩基対、または150塩基対の読み取り長さについて、それぞれ、1.5倍、1倍、または0.6xのボリュームをサンプリングするために、ビーズの比率を使用しています。 10 mMトリスpHが8.0の15μLで溶出。 ライブラリー14のサイズ分布を確認するためにフラグメント分析のサンプルを実行します。サイズ分布は均等に150から900塩基対に分散させる必要があります。 定量PCRを使用してサンプルを定量化ライブラリー定量キットを使用して、キットの説明書15に従って定量PCR反応を設定します。正の標準（キットからのDNA標準）と負の標準（水または他のブランク溶液）を追加する列を空白のままにします。 FOLとして熱サイクル安値：95°C、5分（4.8℃/秒のランプ速度）と95℃、30秒（4.8℃/秒のランプ速度）と2.5の60°C、45秒（ランプ速度の35サイクル°C /秒）。 プーリングフローセル上の多くのレーンが必要とされる方法を決定し、レーンあたり1グループと、グループにサンプルを分けます。 サンプルのグループごとに、ステップ3.5.2からのqPCRデータに基づいて、最も低い濃度のサンプルを選択し、10 mMトリスpHは8.0を使用してその濃度に、そのグループ内のすべてのサンプルを正規化します。 一緒に、各グループ内のサンプルをプール。 シークエンシング標準的な手順16以下の次世代シーケンシングマシンの負荷プール。 4.データ解析注：UNIXベースの環境は、このセクションではプログラムやスクリプトを実行するために必要です。その中で、以下のプロトコールに記載されたソフトウェアをインストールします。ンストールガイド。すべてのスクリプトはhttps://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/で見つけることができます。 FASTX-Toolkitのバージョン0.0.13 17からfastx_trimmerを使用して、40-ntのに読み込みトリム。 fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq デフォルトのオプション18でBWAのバージョン0.6.1を使用して、適切な参照ゲノム（マウス用MM9、人間のためのhg19）に読み込む合わせます。 BWAのAlN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai BWA samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam SAMToolsバージョン0.1.19 19を使用して、得られた BAMファイルにcHRMとランダム染色体への整列を削除し、その後、ソートとインデックス。 grepの-v -wにcHRM example.sam | grepの-vランダム> example.filtered.sam samtoolsは-uSh example.filtered.samを見ます|ソートsamtools – example.filtered samtoolsインデックスexample.filtered.bam CNVを検出するためにHMMcopyを実行します。= "外部参照"> 20 ゲノムのためのGCの割合参照ファイルを生成するHMMcopyにgcCounterを使用してください。ウィンドウサイズを指定するには、「500000 -w」オプションを使用します。ステップ4.2で使用されるFASTA参照ファイルの同じバージョンを使用しますが、にcHRMとランダム染色体はFASTAファイルから削除されていることを確認してください。 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig -w gcCounter mappabilityためのウィグルファイルを生成するHMMcopyにgenerateMap.plを使用してください。長さを読んで指定するには、「40 -w」オプションを使用します。ステップ4.4.1で使用したのと同じFASTA参照ファイルを使用してください。 generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig ゲノムのためのmappability参照ファイルを生成するHMMcopyにmapCounterを使用してください。ウィンドウサイズを指定するには、「500000 -w」オプションを使用します。 500000 -w mapCounter mm9.bigwig> mm9_map.wig 各BAMファイルのウィグルファイルを生成するHMMcopyにreadCounterを使用してください。 readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig </l私> 4.4.1で上記生成されたファイル（ 例えば 、mm9_gc.wig）および4.4.3（ 例えば 、mm9_mapを使用し、（run_hmmcopy.mm9.rまたはrun_hmmcopy.hg19.r）Rスクリプトで参照ファイルへのパスを変更します。それぞれ、GC百分率参照ファイルとmappability参照ファイルを参照する変数GFILEとMFILE、用かつら）。そして、提供さRスクリプト」run_hmmcopy.mm9.r」または「run_hmmcopy.hg19.r」を実行します。 R CMD BATCHにrun_hmmcopy.mm9.r または R CMD BATCHにrun_hmmcopy.hg19.r BAMファイルのセットのバッチ処理のために、単一のフォルダにBAMファイルを置くと、セグメントを呼び出すと変動スコア（VS）を計算するためのパッケージで提供されるスクリプト「HMMpipe.pl」を実行します。フォーマットに従ってください： perlのHMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9 CNV 21を検出するためにDNAcopyを実行します。 一意にBAMファイルから読み込み、マップされた抽出するためにSAMtoolsバージョン0.1.19を使用してください。 samtools表示-h -F 0x0004のexample.filtered.bam | egrepの-i "^ @ | XT：U" | samtoolsは-Shuを表示 – > example.mapped.bam 22ファイル BAMにPCR重複をマークするためにピカールバージョン1.94でMarkDuplicatesを使用してください。 MarkDuplicates.jar入力-jar javaの= example.mapped.bamのOUTPUT = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES =真提供BEDファイル」mm9.500k.dynamic.win.bed」または「hg19.500k.dynamic.win.bed」23で定義済みの動的500キロバイトのマッピング可能なウィンドウのそれぞれに読み込むマッピングされたカウントするbedtoolsバージョン2.17.0でcoveragebedを使用します。 coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts |ソート-k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts 提供GC含量参照ファイル」mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt」または「hg19.500k.dynamic.win.faに基づいて、リードカウントを正規化するために提供されるPerlスクリプト「normalizeGC.pl "を使用してください。 gc.txt」。 perlのnormalizeGC。PL mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts セグメントを呼び出すために設けられたRスクリプト」dnacopy.r "を使用してください。 R CMDバッチdnacopy.r CNVを特定 4.4.6で計算されたVSが0.26を超えている細胞を除外します。 中央値は log 2比は0.4（推定ゲイン）未満または-0.35（推定損失）よりも大きいためにのみが含まれるように4.4.6にHMMcopyによって呼び出されたセグメントをフィルタリングします。 セグメントは、平均0.6より大きく1.32以下であるもののみのために含まれるように4.5.5にDNAcopyによって呼び出されたセグメントをフィルタリングします。 のみHMMcopyとDNAcopy両方が推定されるゲインまたは推定損失を特定の地域でのCNVを呼び出し、4.6.2および4.6.3からのセグメントをオーバーラップします。