Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

1. isolare le cellule singole Preparare il microaspirator Rimuovere la fine di plastica trasparente dal gruppo del tubo di aspirazione e inserire l'estremità più stretta in una estremità di un 1 piede lungo tubo in PVC con "diametro interno 3/16. Inserire l'uscita di un filtro a siringa da 0,2 micron nell'altra estremità del 1 piede lungo tubo in PVC con "diametro interno 3/6. Inserire l'ingresso del filtro a siringa da 0,2 micron in una estremità di un 6 pollici di lunghezza tubo in PVC con "diametro interno 5/16. Opzionale: Tagliare il tubo da 6 pollici a lungo PVC con "diametro interno 5/16 a metà e inserire un sifone in linea tra le due metà. Rompere una pipetta da 5 ml in plastica sierologica al 1 ml laurea e inserire l'estremità rotta nell'estremità aperta del tubo in PVC con "diametro interno 5/16. Inserire l'uscita della pipetta sierologica 5 mL di plastica nella estremità flessibile di un gruppo del tubo aspiratore (dove l'estremità di plastica trasparenteera stato rimosso). Per la conservazione, coprire il boccaglio rosso del gruppo del tubo di aspirazione con un tubo di plastica sterile. Disegnare un capillare di vetro ad un diametro interno di 10-30 micron portando la metà del tubo in prossimità di un becco Bunsen e applicando tensione su entrambe le estremità del tubo. Rompere il tubo trafilato in mezzo per creare due potenziali aghi aspiratore. Ripetere questa operazione con diversi tubi in quanto solo alcuni tubi finirà con un diametro interno che è appropriato per la raccolta di singole cellule. Per lo stoccaggio, posizionare due strisce di plastilina in una capsula di Petri 15 centimetri e fissare gli aghi di aspirazione attraverso le strisce. raccogliere le cellule Preparare una sospensione singola cella come appropriato per il tipo di cella e sperimentare. Ad esempio, per preparare cellule aderenti, come le linee umani fibroblasti cellule, le cellule di raccolta di cellule tripsinizzazione e trasferirli in un tubo conico contenente adeguato supporto. Prima, durante, oopo preparazione della sospensione singola cella (a seconda di quanto tempo ci vuole per preparare la sospensione singola cella), impostare il cappuccio per tutta l'amplificazione del genoma. Spruzzare lungo la superficie del cofano, scatole di punta della pipetta e puntali per pipette con il 10% di candeggina e asciugare con un tovagliolo di carta. Ripetere questa operazione con il 70% di etanolo. Aggiungere 8 ml di acqua dal kit di amplificazione del genoma intero (WGA) a singoli pozzetti di una piastra di pozzetti 96 PCR, un pozzetto per ogni cella da sequenziare. Coprire il 96 pozzetti PCR con un coperchio da una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti e posto su ghiaccio. Aggiungere a 1000 cellule per 10 mL media o tampone fosfato (PBS) in una piastra Petri 15 cm e posizionare il piatto sul ghiaccio per impedire alle cellule di aderire al piatto. Portare le cellule nella piastra di Petri e pozzetti 96 piastra PCR con coperchio su ghiaccio per un microscopio ottico con obiettivo 10X. Aumentare l'apertura dell'ago dell'aspiratore picchiettando delicatamente la fine disegnata su the aspiratore ago su una superficie dura in modo tale che la punta si interrompe. Inserire l'estremità larga dell'ago di aspirazione in chiaro fine del microaspirator. Porre la capsula di Petri contenente cellule sul palco microscopio. Posizionare il boccaglio rossa dell'aspiratore in bocca. Con una mano per spostare l'ago aspiratore e l'altra mano per spostare la piastra di Petri contenente cellule. Identificare singole cellule da sequenziato. Usare la bocca di aspirazione, disegnare una singola cella nel ago aspiratore con ~ 1-2 ml di supporto o PBS. Trasferire la cella in 8 ml di acqua all'interno di un singolo pozzetto della piastra a 96 pozzetti PCR. Evitare l'introduzione di bolle durante il trasferimento alla cella. Ripetere il punto 1.2.7 fino a quando è stato isolato il numero desiderato di cellule. Mantenere la piastra PCR su ghiaccio e coperto con coperchio tra cellule raccolta. Segnare i pozzi che hanno ricevuto le cellule. Mentre la raccolta singole cellule, scongelare il 10X singolo lisi cellulare e buffer di frammentazione da tutta gKit di amplificazione enome. Dopo aver raccolto il numero desiderato di celle, procedere immediatamente a tutto amplificazione del genoma. 2. Whole Genome Amplification Per prevenire la contaminazione durante tutto l'amplificazione del genoma, aggiungere tutti i reagenti all'interno di una cappa di coltura di tessuti, utilizzare puntali per pipette con filtri, e cambiare il puntale tra i pozzi. Preparare una soluzione di lisi e la frammentazione tampone di lavoro dal kit intero genoma di amplificazione (WGA). Per ogni set di fino a 32 celle, unire 32 ml di 10x singola lisi cellulare e buffer di frammentazione e 2 ml di proteinasi K soluzione in una provetta. Agitare la provetta per mescolare le soluzioni. Aggiungere 1 ml di lisi e soluzione tampone frammentazione di lavoro per ciascun bene e pipettare su e giù per mescolare. Coprire la piastra e sigillare tutti i pozzetti con un film plastico. centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice. ciclo termico come follOWS: 50 ° C, 1 h e 99 ° C, 4 min. Raffreddare la piastra su ghiaccio e centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice. Preparare una soluzione tampone di preparazione biblioteca di lavoro da tutto il kit di amplificazione del genoma. Per ogni cella, unire 2 ml di 1x tampone preparazione singola libreria di celle e 1 ml di soluzione di stabilizzazione biblioteca in una provetta. Preparare la soluzione di lavoro per diverse celle nella stessa provetta. Rimuovere la pellicola di plastica e aggiungere 3 ml di soluzione di tampone di preparazione libreria per ogni pozzetto. Pipettare il contenuto del bene su e giù per mescolare. Sostituire la pellicola di plastica. NOTA: La pellicola di plastica può essere riutilizzata durante l'intero processo genoma di amplificazione fino pozzetti iniziano a fori nella pellicola. Quando si verifica ciò, passare a un nuovo film di plastica. Brevemente centrifugare la piastra in una mini piatto ogiva e incubare a 95 ° C per 2 min. Raffreddare la piastra su ghiaccio e brevementecentrifugare la piastra in un mini piatto filatrice. Rimuovere la pellicola di plastica, aggiungere 1 ml enzima preparazione libreria per ogni bene, e pipetta il contenuto del bene su e giù per mescolare. Mantenere l'enzima preparazione biblioteca sul ghiaccio o in un blocco freddo in tutta questa fase. Sostituire la pellicola di plastica. Brevemente centrifugare la piastra in mini filatore piastra e ciclo termico come segue: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, e mantenere a 4 ° C. Raffreddare la piastra su ghiaccio e centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice. Preparare una miscela di amplificazione di lavoro da tutto il kit di amplificazione del genoma. Per ogni cella, unire 48,5 acqua ml, 7.5 ml 10x amplificazione master mix, e 5 ml WGA DNA polimerasi in una provetta. Preparare la miscela di lavoro per diverse celle nella stessa provetta. Mantenere il mix di lavoro sul ghiaccio. Rimuovere la pellicola di plastica, aggiungere 61 ml di lavoro mix di amplificazionead ogni bene, e il contenuto della pipetta di bene su e giù per mescolare. Tenere il mix di amplificazione a lavorare su ghiaccio o in un blocco freddo in tutta questa fase. Sostituire la pellicola di plastica. Brevemente centrifugare la piastra in una mini piatto girevole e il ciclo termico seguente: 95 ° C, 3 min, 25 cicli di 94 ° C, 30 sec e 65 ° C, 5 min, e mantenere a 4 ° C. Trasferimento 60 ml di ogni campione in una provetta separata e conservare a – 20 ° C per l'uso al punto 3. Aggiungere dye DNA loading al restante volume di ogni campione (3 ml di 6x DNA loading dye a 15 microlitri di campione) e funzionamento 5 microlitri da ogni reazione su un gel di agarosio 1%. NOTA: Le cellule che amplificati con successo apparirà come uno striscio da 250 a 1000 bp. I campioni che non presentano una sbavatura o mostrano solo una macchia debole è improbabile per produrre dati di sequenziamento utili. 3. Sequencing Purificare i campioni con perline paramagnetici. Thacampioni di DNA W sul ghiaccio. perline Vortex paramagnetici fino a quando la soluzione è omogenea e incubare le perline a temperatura ambiente per almeno 30 min. Trasferire 20 ml di ogni campione di DNA in una provetta pulita. Il resto del campione può essere conservato a -20 ° C. Aggiungere 30 ml (1.5x) di perline paramagnetici ad ogni campione di DNA e vortex per miscelare. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min. Lasciare la soluzione stock di perline a temperatura ambiente per l'uso nel passo 3.4. Posizionare i tubi su una striscia magnetica tubo per 2 minuti, o fino a quando le perle formano un pellet e il surnatante è chiaro. Usando una pipetta P200, rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile senza disturbare le perline. Aggiungere 180 ml di 80% di etanolo alla miscela DNA-tallone. Ruotare i tubi diverse volte rispetto al magnete di "lavaggio" le perle attraverso la soluzione di etanolo. Usando una pipetta P200, rimuovere la maggior quantità di lavaggio etanolo come posBLE senza disturbare le perline. Ripetere 3.1.6 e 3.1.7. Far asciugare le perle per circa 10 minuti o fino a quando non è più l'etanolo è visibile. Procedere alla fase successiva, quando le perline appaiono rotti o cadere dalla parete del tubo. Rimuovere i campioni dalla striscia magnetica. Aggiungere 40 ml di 10 mM Tris pH 8,0 per eluire il DNA dalle perline e vortice dei campioni per risospendere le sfere. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. centrifugare brevemente i campioni per raccogliere il liquido sul fondo del tubo e posizionare i tubi su una striscia magnetica tubo per almeno due minuti. Trasferire il eluente in provette da microcentrifuga puliti senza disturbare le perline. normalizzazione del campione Quantificare la concentrazione di ogni campione utilizzando uno spettrofotometro. Le concentrazioni dovrebbero variare da 10 a 30 ng / mL. Diluire ciascun campione a 0,2 ng / ml usando 10 mM Tris pH 8,0. Le seguenti operazioni richiedono un minimo input di 5 ml di questa diluizione. preparazione Biblioteca Preparare le librerie di sequenziamento seguendo le istruzioni del kit di preparazione libreria 13. pulizia finale Pulire i campioni in base al passo 3.1. Per lunghezze di lettura di 50 bp, 75 bp, o 150 punti base, utilizzare un rapporto di tallone di assaggiare volume di 1,5x, 1x, o 0.6x, rispettivamente. Eluire con 15 ml di 10 mM Tris pH 8.0. Eseguire i campioni su un analizzatore frammento controlla la distribuzione delle dimensioni della libreria 14. La distribuzione dimensionale dovrebbe essere uniformemente diffondersi da 150 al 900 bp. Quantificare i campioni utilizzando qPCR Utilizzando un kit di quantificazione biblioteca, impostare una reazione qPCR secondo le istruzioni del kit 15. Lascia un vuoto di colonna per aggiungere norme positive (norme DNA del kit) e gli standard negativi (acqua o altra soluzione vuota). ciclo termico come Folbassi: 95 ° C, 5 min (velocità di rampa di 4,8 ° C / sec) e 35 cicli di 95 ° C, 30 sec (velocità di rampa di 4,8 ° C / sec) e 60 ° C, 45 sec (velocità di rampa di 2,5 ° C / sec). pooling Determinare come sono necessarie molte corsie sulla cella a flusso e dividere i campioni in gruppi, con un gruppo per corsia. Per ciascun gruppo di campioni, scegliere il campione con la più bassa concentrazione sulla base dei dati qPCR dal punto 3.5.2 e normalizzare tutti i campioni in quel gruppo a detta concentrazione utilizzando 10 mM Tris pH 8,0. Pool i campioni in ciascun gruppo insieme. sequencing Piscine di carico sulla macchina di sequenziamento di prossima generazione seguenti procedure standard 16. Analisi 4. I dati NOTA: Un ambiente basato su Unix è necessario per eseguire i programmi e gli script in questa sezione. Installare il software di cui al protocollo dopo la loro in guide instal-. Tutti gli script possono essere trovati a https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/. Tagliare la legge a 40-nt utilizzando fastx_trimmer da FASTX-Toolkit versione 0.0.13 17. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq Allineare la legge al genoma appropriata di riferimento (MM9 per il mouse, hg19 per l'uomo) con BWA versione 0.6.1 con le opzioni di default 18. bwa aln mm9.fa example.trim.fastq> example.sai bwa Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam Rimuovere allineamenti di CHRM e cromosomi casuali, quindi ordinare e indicizzare il file BAM risultante utilizzando SAMTools versione 0.1.19 19. grep -v -w CHRM example.sam | grep -v casuale> example.filtered.sam samtools vista example.filtered.sam -uSh | samtools sorta – example.filtered samtools indice example.filtered.bam Eseguire HMMcopy per rilevare CNV= "Xref"> 20 Utilizzare gcCounter in HMMcopy per generare un file di riferimento percentuale di GC per il genoma. Utilizzare l'opzione "w 500000" per specificare la dimensione della finestra. Utilizzare la stessa versione del file di riferimento FASTA utilizzato nel passaggio 4.2, ma fare in modo CHRM e cromosomi casuali vengono rimossi dal file FASTA. gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig Utilizzare generateMap.pl in HMMcopy per generare un file di manovra per mappability. Utilizzare l'opzione "w 40" per specificare leggere lunghezza. Utilizzare lo stesso file di riferimento fasta utilizzato nel passaggio 4.4.1. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig Utilizzare mapCounter in HMMcopy per generare un file di riferimento mappability per il genoma. Utilizzare l'opzione "w 500000" per specificare la dimensione della finestra. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig Utilizzare readCounter in HMMcopy per generare un file di manovra per ogni file BAM. readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig </li> Modificare i percorsi dei file di riferimento negli script R (run_hmmcopy.mm9.r o run_hmmcopy.hg19.r), usare i file generati sopra a 4.4.1 (ad esempio, mm9_gc.wig) e 4.4.3 (per esempio, mm9_map. parrucca) per le variabili gfile e MFILE, che si riferiscono al file di riferimento percentuale di GC e riferimento mappability, rispettivamente. Quindi eseguire lo script R fornito "run_hmmcopy.mm9.r" o "run_hmmcopy.hg19.r". R CMD LOTTO run_hmmcopy.mm9.r o R CMD LOTTO run_hmmcopy.hg19.r Per l'elaborazione in batch di un insieme di file BAM, inserire i file BAM in una singola cartella ed eseguire lo script fornito "HMMpipe.pl" nel pacchetto di chiamare i segmenti e calcolare i punteggi di variabilità (VS). Seguire il formato: perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9 Eseguire DNAcopy per rilevare CNV 21. Utilizzare SAMtools versione 0.1.19 per estrarre mappata univocamente legge da ciascun file BAM. Vista samtools -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools vista -shu -> example.mapped.bam Utilizzare MarkDuplicates in Picard versione 1.94 per contrassegnare i duplicati PCR nel BAM file di 22. java -jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam USCITA = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true Utilizzare coveragebed in bedtools versione 2.17.0 per contare mappato legge in ciascuna delle finestre dinamica 500kb mappabili predefiniti nel file da letto disponibile "mm9.500k.dynamic.win.bed" o "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sorta -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts Utilizzare lo script Perl fornito "normalizeGC.pl" per normalizzare i conteggi di lettura in base alla condizione file di riferimento contenuto GC "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" o "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ". perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts Utilizzare la R script "dnacopy.r" fornito a chiamare i segmenti. R CMD LOTTO dnacopy.r identificare CNV Escludere le cellule per i quali il VS calcolato 4.4.6 supera 0,26. Filtrare i segmenti chiamati da HMMcopy in 4.4.6 per includere solo quelli per i quali il rapporto mediana log 2 è maggiore di 0,4 (guadagno putativo) o meno di -0.35 (perdita putativo). Filtrare i segmenti chiamati da DNAcopy in 4.5.5 per includere solo quelli per i quali il segmento media è maggiore di 1,32 o inferiore a 0,6. Sovrapporre i segmenti da 4.6.2 e 4.6.3, chiamando CNV solo nelle regioni in cui sia HMMcopy e DNAcopy identificano un guadagno o una perdita putativo putativo.