איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Department of Biology,Massachusetts Institute of Technology, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Division of Health Sciences and Technology,Harvard Medical School, 4The Barbara K. Ostrom (1978) Bioinformatics and Computing Facility in the Swanson Biotechnology Center, Koch Institute for Integrative Cancer Research,Massachusetts Institute of Technology, 5BioMicro Center, Department of Biology,Massachusetts Institute of Technology
Summary
רצף תא בודד הוא כלי פופולרי ונגיש יותר ויותר לטיפול שינויים הגנומי ברזולוציה גבוהה. אנו מספקים פרוטוקול המשתמש רצף תא בודד לזהות שינויי מספר עותק תאים בודדים.
Abstract
איתור של שינויים גנומיים ברזולוצית תא בודדת חשוב לאפיון מגוון גנטי ואבולוציה ברקמות נורמליות, סרטן, ואוכלוסיות מיקרוביאלי. שיטות מסורתיות להערכת הטרוגניות גנטית היו מוגבלות על ידי ברזולוציה נמוכה, רגישות נמוכה, ו / או סגולי נמוך. רצף תא יחיד התפתח ככלי רב עצמה לאיתור הטרוגניות גנטית עם רזולוציה גבוהה, רגישות גבוהה, כאשר נותחו כראוי, סגולי גבוה. כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור הבידוד, הגברת הגנום כולו, רצף, וניתוח של תאים בודדים. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי האמין של וריאנטים מספר עותק megabase מידת תאים בודדים. עם זאת, היבטים של פרוטוקול זה יכול להיות מיושמים גם לחקור סוגים אחרים של שינויים גנטיים בתאים יחידים.
Introduction
שינויים במספר עותק דנ"א יכול טווח בגודל מכמה זוגות בסיסים (מספר עותק וריאנטים) (CNVs) לכרומוזומים כולו (aneuploidy). שינויים במספר ההעתק המשפיעים אזורים גדולים של הגנום יכולים להיות השלכות פנוטיפי משמעותיות על ידי שינוי הביטוי של עד אלף גנים 1, 2. CNVs שנמצא בכל התאים של אוכלוסייה יכולה להיות מזוהה על ידי רצף בתפזורת או בשיטות מבוססות microarray 3, 4. עם זאת, אוכלוסיות גם יכולות להיות גנטי הטרוגנית, עם CNVs קיים קבוצת משנה של האוכלוסייה או אפילו תאים בודדים. מגוון גנטי שכיח סרטן, נהיגת התפתחות גידול, וגם נוכח ברקמות נורמליות, עם תוצאה לא ידועה 5, 6, 7, 8, 9 <sup>, 10.
באופן מסורתי, מגוון גנטי הוערך באמצעות גישות ציטולוגיה או רצף בתפזורת. גישות ציטולוגיה, כגון קרינת כלאה באתרו (FISH), ממרחים כרומוזום, ואת karyotyping ספקטרלי (SKY), יש את היתרון של שינויים בזיהוי נוכחיים בתאים בודדים אבל יש שיעורי לטעות גבוהים עקב ממצאים של כלאה והפצת 11. גישות אלה מוגבלות גם מספר חושף ההעתק בלבד פתרונם משתנות פורשות כמה megabases. רצף או microarrays של DNA בתפזורת, אם כי גבוה דיוק ורזולוציה, הוא פחות רגיש. כדי לזהות מגוון גנטי על ידי גישות מבוססות אוכלוסייה, הגירסות חייבות להיות נוכחות חלק ניכר של תאים באוכלוסייה. הופעה של שיטות כדי להגביר את הדנ"א הגנומי של תאים בודדים הפך אותו ניתן לרצף את הגנום של תאים בודדים. seque תא יחידיש ncing היתרונות של רזולוציה גבוהה, רגישות גבוהה, וכאשר שיטות בקרה איכות מתאימות מוחלות, גבוה דיוק 12.
כאן אנו מתארים שיטה לגילוי שינויים במספר עותק בקנה מידה megabase ב תאים בודדים. אנו לבודד תאים בודדים על ידי מיקרו אספירציות, להגביר הדנ"א הגנומי באמצעות מתאם מקשר PCR, להכין ספריות עבור סידור הדור הבא, וכדי לזהות מספר עותק וריאנטים הן על ידי מודל מרקוב חבוי ופילוח בינארי מעגלית.
Protocol
1. בידוד תאים בודדים הכן את microaspirator הסר את הקצה פלסטיק שקוף ממכלול aspirator צינור והכנס את הקצה הצר אל קצה אחד של צינורות PVC 1 רגל ארוכה עם 3/16 "קוטר פנימי. הכנס את השקע של מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר לתוך הקצה השני של צינורות PVC 1 רגל הארוכה עם 3/6 "קוטר פנימי. הכנס את הכניסה של מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר לתוך קצה אחד של צינורות PVC 6 אינץ 'ארוך עם 5/16 "קוטר פנימי. אופציונלי: חותכים את צינורות PVC באורך שני סנטימטרים וחצי 6 עם 5/16 "קוטר פנימי לשניים ולהכניס מלכודת המים אונליין בין שני החצאים. לשבור פיפטה סרולוגיות פלסטיק 5 מ"ל ב 1 הסיום מ"ל והכנס את הקצה הקרוע אל הקצה הפתוח של הצינור PVC עם 5/16 "קוטר פנימי. הכנס את היציאה של פיפטה 5 מיליליטר פלסטיק סרולוגיות לתוך הסוף הגמיש של הרכבת צינור aspirator (שסיומו הפלסטיק השקוףהוסר). עבור אחסון, מכסה את פומית הטלפון האדומה של הרכבת צינור aspirator עם צינור פלסטיק סטרילית. צייר את צינור נימי זכוכית בקוטר פנימי של 10-30 מיקרומטר ידי הבאה באמצע הצינור ליד להבת מבער בונזן ויישום מתח על צד אחר של הצינור. לשבור את הצינור נמשך באמצע כדי ליצור שתי מחטים aspirator פוטנציאליים. חזור על פעולה זו עם מספר צינורות כמו שרק כמה צינורות יהיו בסופו של דבר עם קוטר פנימי המתאים לקטיף תאים בודדים. עבור אחסון, הנח שתי רצועות של פלסטלינה בצלחת 15 ס"מ פטרי ולאבטח את המחטים aspirator פני רצועות. פיק תאים כן השעית תא בודד בהתאם לסוג התא ולהתנסות. לדוגמא, כדי להכין תאים חסידים כגון שורות תאי פיברובלסטים אדם, תאי קציר על ידי תאי trypsinization ו והעבירו צינור חרוטים המכילים חומרי הדפסה מתאימות. לפני, במהלך, אוחרה הכנת השעית התא הבודדה (תלוי כמה זמן לוקח להכין את השעית התא הבודדה), להגדיר את מכסה מנוע הגברת הגנום כולו. תרסיס למטה פני השטח של מכסה המנוע, תיבות קצה פיפטה, וטיפים פיפטה עם אקונומיקה 10% ולנגב במגבת נייר. חזור על פעולה זו עם 70% אתנול. הוסף 8 μL של מים מן הגברת הגנום כולו (WGA) ערכתי לבארות בודדות של צלחת 96-היטב PCR, גם אחד עבור כל תא כדי להיות רצף. מכסים את צלחת 96-היטב PCR עם מכסה מהצלחת בתרבית רקמה 96-היטב ומניחים על קרח. להוסיף 1,000 תאים 10 מ"ל התקשורת או פוספט בופר סליין (PBS) בצלחת 15 ס"מ פטרי במקום צלחת על הקרח כדי למנוע את התאים מפני דבקות המנה. תביא את התאים בצלחת פטרי צלחת 96-היטב PCR עם מכסה על קרח כדי מיקרוסקופ אור עם מטרת 10X. גדל פתיחת מחט aspirator ידי קשה סוף והמוארך בעדינות של המחט דואר aspirator על משטח קשה כזה הקצה השתתק. הכנס את הקצה הרחב של מחט aspirator אל הקצה הברור של microaspirator. מניחים את צלחת פטרי המכילה תאים על הבמה מיקרוסקופ. מניח את הפיה האדומה של aspirator בפה. השתמש ביד אחת כדי להזיז את המחט aspirator ואת היד השנייה כדי להעביר את צלחת פטרי המכילה תאים. לזהות תאים בודדים כדי להיות רצף. באמצעות יניקת פה, לצייר תא בודד לתוך מחט aspirator יחד עם ~ 1-2 μL של תקשורת או PBS. מעביר את התא אל 8 μL של מים בתוך באר אחת של צלחת 96-היטב PCR. הימנע החדרת בועות בעת העברת התא. חזור על שלב 1.2.7 עד מספר התאים הרצוי בודד. שמור את הצלחת PCR על הקרח מכוסה במכסה בין תאים לקטוף. סמן את הבארות שקבלו תאים. בעוד לקטוף תאים בודדים, להפשיר את תמוגה תא בודד 10X חיץ הפיצול מן g כולוערכת הגברה enome. לאחר לקטוף את המספר הרצוי של תאים, יש לפנות מייד הגברת הגנום כולו. 2. הגברת הגנום כולו כדי למנוע זיהום במהלך הגברת הגנום כולו, להוסיף את כל החומרים כימיים בתוך ברדס בתרבית רקמה, השתמש טיפים פיפטה עם מסננים, ולשנות את הקצה פיפטה בין בארות. כן פתרון חיץ תמוגה ופיצול עובד מן הגברת הגנום כולו (WGA) הערכה. לכל קבוצה של עד 32 תאים, לשלב 32 μL של 10x תמוגה תא בודד חיץ הפיצול 2 μL של פתרון K proteinase בתוך שפופרת microcentrifuge. וורטקס הצינור לערבב הפתרונות. הוסף 1 μL של עובד תמוגה פתרון חיץ הפיצול זה היטב פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. מכסה את הצלחת ולאטום את כל הבארות עם סרט פלסטיק. צנטריפוגות בקצרה את צלחת טווית הצלחה מיני. מחזור תרמי כמו follOWS: 50 ° C, 1 שעות 99 מעלות צלזיוס, 4 דק '. מצנן את הצלחת על קרח בקצרה צנטריפוגות צלחת טווית הצלחה מיני. כן פתרון חיץ כנת ספרייה עובד מן ערכת הגברת הגנום כולו. עבור כל תא, לשלב 2 μL של חיץ הכנה הספרייה תא בודד 1x ו 1 μL של פתרון ייצוב הספרייה בתוך שפופרת microcentrifuge. הכן את הפתרון עובד עבור תאים יחד באותה צינור microcentrifuge. הסר את הסרט הפלסטי ולהוסיף 3 μL של פתרון עובד חיץ כנת ספרייה היטב כל אחד. פיפטה את התוכן של הבאר למעלה ולמטה כדי לערבב. החזר את הסרט הפלסטי. הערה: סרט הפלסטיק ניתן לעשות שימוש חוזר לאורך כל תהליך הגברת הגנום כולו עד בארות המתחילים בולש בסרט. כאשר זה קורה, לעבור סרט פלסטיק חדש. צנטריפוגות בקצרה את צלחת טווית הצלחה מיני לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מצננים את הצלחת על קרח בקצרהבצנטריפוגה צלחת טווית הצלחה מיני. הסר את הסרט הפלסטי, להוסיף 1 μL אנזים כנה ספרייה זה טוב, ו פיפטה את התוכן של הבאר למעלה ולמטה כדי לערבב. שמור את האנזים כנה ספרייה על קרח או בתוך גוש קר לאורך שלב זה. החזר את הסרט הפלסטי. צנטריפוגות בקצרה את צלחת טווית הצלחה מיני מחזור תרמי כדלקמן: 16 ° C, 20 דקות, 24 ° C, 20 דקות, 37 ° C, 20 דקות, 75 ° C, 5 דקות, והחזק על 4 מעלות צלזיוס. מצנן את הצלחת על קרח בקצרה צנטריפוגות צלחת טווית הצלחה מיני. להכין תערובת הגברה עובדת מן ערכת הגברת הגנום כולו. עבור כל תא, המשלבים מים 48.5 μL, 7.5 μL 10x הגברה תערובת הורים, ו -5 פולימראז μL WGA DNA בתוך שפופרת microcentrifuge. מכינים את תערובת עובד עבור תאים יחד באותה צינור microcentrifuge. שמור את התערובת עובדת על קרח. הסר את הסרט הפלסטי, להוסיף 61 μL לעבוד תמהיל הגברהזה טוב, פיפטה תוכן גם מעלה ומטה כדי לערבב. שמור את תערובת ההגברה עובדת על קרח או בתוך גוש קר לאורך שלב זה. החזר את הסרט הפלסטי. צנטריפוגות בקצרה את צלחת טווית הצלחה מיני מחזור תרמי כדלקמן: 95 ° C, 3 דקות, 25 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ו 65 מעלות צלזיוס, 5 דקות, והחזק על 4 מעלות צלזיוס. העברת 60 μL של כל דגימה לצינור ולאחסן microcentrifuge נפרד – 20 ° C לשימוש בשלב 3. להוסיף צבע טעינת DNA נפח הנותרים של כל דגימה (כלומר 3 μL של 6x DNA צבע טעינת עד 15 μL של המדגם) ולהפעיל 5 μL מכל תגובה על ג'ל agarose 1%. הערה: תאים מוגבר בהצלחה יופיע ככתם מ 250 עד 1000 נ"ב. דוגמאות שאינן מראות מריחות או רק להראות מבחין בכתם קלוש צפויות להניב נתוני רצף שימושיים. רצף 3. לטהר דגימות עם חרוזים פאראמגנטיים. thaדגימות DNA w על הקרח. וורטקס חרוזים פאראמגנטיים עד הפתרון הוא הומוגני דגירה חרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. העבר 20 μL של כל דגימת DNA לתוך צינור microcentrifuge נקי. שאר המדגם ניתן לאחסן ב -20 ° C. הוסף 30 μL (1.5x) של חרוזים פאראמגנטיים לכל דגימת DNA מערבולת לערבב. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השאירו את פתרון המניות של חרוזים בטמפרטורת החדר לשימוש צעד 3.4. מניחים את הצינורות על רצועת צינור מגנטי למשך 2 דקות, או עד חרוזים צורה כדורית ואת supernatant ברור. בעזרת פיפטה P200, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע חרוזים. להוסיף 180 μL של אתנול 80% לתערובת DNA חרוז. סובב את הצינורות כמה פעמים ביחס המגנט "לשטוף" את החרוזים באמצעות הפתרון אתנול. בעזרת פיפטה P200, להסיר כמה שיותר לשטוף אתנול כמו possible מבלי להפריע את החרוזים. חזור 3.1.6 ו 3.1.7. האוויר יבש חרוז למשך כ -10 דקות או עד שלא אתנול יותר גלוי. המשך לשלב הבא כאשר חרוזים להופיע סדוק או ליפול מהקיר של הצינור. הסר את הדגימות מן הפס המגנטי. הוסף 40 μL של 10 מ"מ טריס pH 8.0 elute את ה- DNA מן החרוזים המערבולת דגימות כדי resuspend את החרוזים. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר. בקצרה בצנטריפוגה הדגימות כדי לאסוף את הנוזל בתחתית של התחתית ומניח את הצינורות על רצועת צינור מגנטית עבור שתי דקות לפחות. מעבירים את eluent לתוך צינורות microcentrifuge נקי מבלי להפריע את החרוזים. נורמליזציה לדוגמא לכמת את הריכוז של כל דגימה באמצעות ספקטרופוטומטר. הריכוזים צריכים לנוע בין 10 ל 30 ng / μL. לדלל מדגם ל -0.2 ng / μL באמצעות 10 מ"מ טריס pH 8.0. השלבים הבאים ידרשו i מינימוםNput 5 μL מדילול זה. הכנה הספרייה הכן ספריות רצף לפי ההנחיות של ערכת הכנה הספרייה 13. ניקוי סופי נקה את הדגימות על פי שלב 3.1. עבור אורכים לקריאה של 50 נקודות בסיס, 75 נ"ב, או 150 נ"ב, השתמש יחס של חרוז לדגום נפח של 1.5x, 1x, או 0.6x, בהתאמה. Elute עם 15 μL של 10 מ"מ טריס pH 8.0. הפעל את הדגימות על מנתח שבר לבדוק את התפלגות הגודל של הספרייה 14. התפלגות הגודל צריך להתפשט באופן שווה 150 כדי 900 נ"ב. לכמת דגימות באמצעות qPCR באמצעות ערכת כימות ספרייה, הקים תגובת qPCR בהתאם להוראות ערכת 15. השאר ריק עמודה כדי להוסיף תקנים חיוביים (סטנדרטים דנ"א בערכה) ותקנים שליליים (מים או פתרון ריק אחר). מחזור תרמי כמו folשפל: 95 ° C, 5 דקות (שיעור הרמפה של 4.8 ° C / sec) ו -35 מחזורים של 95 ° C, 30 שניות (שיעור הרמפה של 4.8 ° C / sec) ו -60 ° C, 45 שניות (שיעור הרמפה של 2.5 ° C / sec). איגום לקבוע את מספר נתיבים על flowcell נדרשים ולחלק את הדגימות לקבוצות, עם קבוצה אחת לכל נתיב. עבור כל קבוצה של דגימות, לבחור את המדגם עם הריכוז הנמוך ביותר על בסיס הנתונים qPCR משלב 3.5.2 לנרמל את כל דגימות כי הקבוצה כי ריכוז באמצעות 10 מ"מ טריס pH 8.0. פינת דגימות בכל קבוצה ביחד. רצף ברכות טענו במחשב רצף הדור הבא בעקבות הליכים סטנדרטיים 16. ניתוח 4. נתונים הערה: סביבה מבוססת יוניקס נדרשה להפעיל את התוכניות ותסריטים בסעיף זה. התקנת התוכנה המוזכרים בפרוטוקול הבא שלהם מדריכי stallation. ניתן למצוא את כל התסריטים בבית https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/. חתוך את הקורא ל -40-NT באמצעות fastx_trimmer מגרסת FASTX-Toolkit 0.0.13 17. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq יישר את מקריא הגנום ההתייחסות המתאים (mm9 לעכבר, hg19 עבור אדם) באמצעות גרסת 0.6.1 BWA עם אפשרויות ברירת מחדל 18. BWA AlN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai BWA samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam סור מערכים כדי chrm וכרומוזומים אקראי, ואז למיין מדד קובץ BAM וכתוצאה מכך באמצעות SAMTools גרסה 0.1.19 19. grep -v -w chrm example.sam | grep -v אקראי> example.filtered.sam samtools להציג example.filtered.sam -uSh | samtools מין – example.filtered מדד samtools example.filtered.bam הפעל HMMcopy לזהות CNVs= "Xref"> 20 השתמש gcCounter ב HMMcopy כדי ליצור קובץ התייחסות אחוז GC עבור הגנום. השתמש באפשרות "-w 500000" כדי לציין את גודל החלון. השתמש באותו גרסת קובץ התייחסות fasta בשימוש בשלב 4.2, אבל להפוך chrm בטוח הכרומוזומים אקראיים יוסרו מקובץ fasta. gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig השתמש generateMap.pl ב HMMcopy כדי ליצור קובץ להתנועע עבור mappability. השתמש באפשרות "-w 40" כדי לציין לקרוא אורך. השתמש באותו קובץ התייחסות fasta בשימוש בשלב 4.4.1. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig השתמש mapCounter ב HMMcopy כדי ליצור קובץ התייחסות mappability עבור הגנום. השתמש באפשרות "-w 500000" כדי לציין את גודל החלון. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig השתמש readCounter ב HMMcopy כדי ליצור קובץ להתנועע עבור כל קובץ BAM. readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig </li> שנה את הנתיבים לקבצים התייחסות סקריפטים R (run_hmmcopy.mm9.r או run_hmmcopy.hg19.r), להשתמש את הקבצים שנוצרו לעיל 4.4.1 (למשל, mm9_gc.wig) ו 4.4.3 (למשל, mm9_map. פאה) עבור המשתנים gfile ו mfile, אשר עיין בחומר עזר הקובץ mappability התייחסות GC אחוז קובץ, בהתאמה. ואז להריץ את הסקריפט R ניתן "run_hmmcopy.mm9.r" או "run_hmmcopy.hg19.r". R CMD BATCH run_hmmcopy.mm9.r אוֹ R CMD BATCH run_hmmcopy.hg19.r עבור עיבוד אצווה של קבוצה של קבצים BAM, לשים את הקבצים BAM בתיקייה אחת ולהפעיל את הסקריפט המסופק "HMMpipe.pl" בחבילה לקרוא מגזרים ולחשב ציונים השתנות (VS). בצע את הפורמט: perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm9 הפעל DNAcopy לזהות CNVs 21. השתמש SAMtools גרסה 0.1.19 לחלץ ממופה באופן ייחודי קורא מתוך כל קובץ BAM. samtools להציג -h -f 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools להציג -Shu -> example.mapped.bam השתמש MarkDuplicates בגירסה פיקארד 1.94 לסמן כפילויות PCR ב BAM להגיש 22. java-jar INPUT MarkDuplicates.jar = OUTPUT example.mapped.bam = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true השתמש coveragebed ב bedtools גרסה 2.17.0 לספור ממופה קורא אחד מחלונות mappable 500KB מוגדרים מראש דינמי בקובץ BED ניתן "mm9.500k.dynamic.win.bed" או "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | מיין -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts השתמש סקריפט Perl ניתן "normalizeGC.pl" לנרמל את ספירת קוראים המבוססים על קובץ עזר תוכן GC ניתן "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" או "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ". perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts השתמש "dnacopy.r" תסריט R ספק לקרוא מגזרים. R CMD BATCH dnacopy.r זהה CNVs אל תכלול תאים שעבורם VS מחושב ב 4.4.6 עולה 0.26. סנן את הפלחים נקראים על ידי HMMcopy ב 4.4.6 לכלול רק אלה שעבורם יחס יומן 2 החציוני עולה 0.4 (רווח משוער) או פחות מ -0.35 (פסד משוער). סנן את הפלחים נקראים על ידי DNAcopy ב 4.5.5 לכלול רק לאלה בם המגזר מתכוון גדול מ 1.32 או פחות מ -0.6. חופף את קטעי פסוקי 4.6.2 ו 4.6.3, קורא CNVs רק באזורים בם הוא HMMcopy ו DNAcopy לזהות רווח משוער או פסד משוער.
Representative Results
Aspirator התאספו אמור להופיע דומה לזו באיור 1 א. המחט צריכה להיגרר כאלה שזה רחב מספיק כדי להכיל תא בודד אבל לא כל כך רחב כי נפח גדול נערך עם התא הבודד. Aspirating תאים בודדים היא הקלה כאשר יש בין אחת לחמש תאים בשדה 10X (איור 1B). אם הגברת הגנום כולו היא מוצלחת, המדגם יופיע ככתם על ג'ל agarose (איור 2, מסלולי 1, 2, 4, 5, 6, ו -7). מבחין בכתם קלוש או נעדר מצביע על תגובת הגברה נכשלה ואת המדגם לא צריך להיות רצף (איור 2, נתיבי 3 ו -8). בעקבות הכנת ספרייה, חלוקת גודל שבר של הדגימות צריכה להיות מוערכת על ידי אלקטרופורזה נימים על נתח שבר.בהצלחת ספריות מוכנות תהיינה חלוקות למדי אפילו בגדלים שברים 150 כדי 900 נ"ב (איור 3, A, B). נכשלתי כנת ספרייה תגרום התפלגות גודל שבר סוטה וספריות כזה לא צריכות להיות רצף (איור 3 ג). עיבוד הנתונים רצף באמצעות מודל מרקוב נסתר (HMMcopy) ופילוח בינארי עגול (DNAcopy) יהיה לנתח את הגנום של כל תא למקטעים של מספר עותק מוערך. מגזרים אלה לאחר מכן ניתן מסוננים לזהות את אלה עם מספר עותק מוערך בקנה אחד עם רווח או הפסד בתא בודד (טבלה 1). מגזרים מסוננים אלה מן HMMcopy ו DNAcopy יש חפיפה ואז לזהות CNVs ברמת ודאות גבוהה. איור 1. בידוד תא יחיד. ( א) התאסף microaspirator. (B) מראה השדה 10X ניתק תאים (חיצים) ומחט microaspirator (בפינה הימנית התחתונה). Aspirating תאים בודדים הוא הקלה כאשר יש בין אחת לחמישה תאים בשדה 10X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. הגברת הגנום כולו. ג'ל אלקטרופורזה agarose של 5 μl של מוצרי הגברה הגנום כולו. דוגמאות כי בהצלחה להגביר יופיע לכתמים בהירים החל מיום 100 נ"ב ל -1 kb (מסלולים 1, 2, 4, 5, 6, ו -7) והוא יכול להיות רצף. דוגמאות שאינו להגביר בהצלחה תפקנה מריחות קלושות או לא למרוח (נתיבים 3 ו -8) ואסור להיות רצף.large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. הכנת הספרייה. תוצאות נציגת מנתח שבר. הגרפים מראים גודל שבר (ב BP) על ציר X ו- יחידות הקרינה היחסית (RFU) על ציר Y. מימין כל גרף הוא שביל ג'ל מדומה. (א) תוצאות עבור מדגם אידיאלי, עם חלוקה שווה בין 150 ל 900 נ"ב וללא פסגות חדות או הטיה כלפי צד אחד. מדגם זה מקובל על רצף. תוצאות (B) מדגימה בסדר, עם התפלגות גודל מוטה כלפי בגדלים שבר נמוכים. אמנם זה לא אופטימלי, המדגם יכול עדיין להיות רצף. (ג) תוצאות ממדגם נכשל, עם גדלים שבר קטן בעיקרה. זו נגרמת ככל הנראה על ידי דגירה ממושכת במהלך שלב tagmentationהכנה הספרייה. מדגם זה לא אמור להיות רצף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. HMMcopy לִטעוֹם מִגזָר Chr הַתחָלָה סוֹף מדינה חֲצִיוֹן D15-4998 23 chr8 144,500,001 146,500,000 6 0.5008794 D15-4998 29 chr10 67,000,001 134,500,000 6 0.4031945 D15-4998 52 גhr19 1 20,000,000 6 0.4616884 D15-4998 57 chrY 1 59,500,000 2 -1.506532 DNAcopy לִטעוֹם Chrom התחל סל סוף bin הַתחָלָה סוֹף ממוצע Seg med Seg D15-4998 chr10 88 197 62,612,945 129,971,511 1.4688 0.157 D15-4998 chr19 0 31 0 28,416,392 1.4141 .1674 D15-4998 chrX 77 126 </td> 51,659,160 95,343,369 1.3548 .1874 D15-4998 chrY 0 14 0 23,805,358 -2.7004 .3591 ניתוח נתונים מהטבלה 1.. מגזרים מסוננים שנוצרו על ידי HMMcopy ו DNAcopy מתא בודד. חופפים שתי תוצאות אלו מגלה רווח על כרומוזום 10 מ 67 130 MB כמו גם רווח על כרומוזום 19 מן 0 כדי 20 MB. מצאנו כי רווחי על החלק הפרוקסימלי של כרומוזום 19 הם תוצר של רצף תא בודד 12.
Discussion
באופן מסורתי, זיהוי CNVs ו aneuploidy ברמה של תאים בודדים נדרשים שיטות ציטולוגיה כגון דגי SKY. עכשיו, רצף תא בודד התפתח גישה חלופית עבור שאלות כאלה. יש רצף תא יחיד יתרונות על פני דגי SKY כפי שהוא הוא הגנום כולו ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, כאשר שיטות בקרה איכות מתאימות מוחלות, רצף תא בודד יכול לספק הערכה אמינה יותר של CNVs ו aneuploidy כפי שהוא לא רגיש וממצאי הכלאה והפצת הטבועות דגי SKY. עם זאת, רבים של היישומים האחרונים של רצף תא בודד לא אושש על ידי הערכה יסודית של הרגישות וסגולית של השיטות ומנתח. ואכן, חלק מן הגישות אנליטית שמוצג מחקרים אחרים המשויכים תדרים גבוהים (> 50%) של שקר חיובית CNV מכנה 12. הגישה נתאר נבדקה בקפדנות באמצעות תאים של KNנטל CNV עצמו כדי לקבוע שיעורי גילוי אמת ושקר לייעל את הרגישות והסגוליות של זיהוי CNV 12. באמצעות בקרת איכות גישות אנליטיות מתוארת בפרוטוקול זה, כ 20% של 5 רווחים Mb, 75% עליה של 5 הפסדים Mb, וכל CNVs עולה על 10 Mb ניתן לאתר. למרות קביעת שיעור גילוי השווא של רצף תא בודד קשה, אנחנו מעריכים שזה יהיה פחות מ -25%. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים ממגוון מקורות, סקריפטים יכול להיות שונה כדי להתאים את הרזולוציה של זיהוי CNV, ואת הפרוטוקול ניתן להתאים לזהות וצורות אחרות של שינויי הגנומי.
יש מגוון של אמצעי מתנער רקמות טריות לתוך תאים בודדים, ורבי פרסומים לתאר הליכים מותאמים במיוחד ברקמות ספציפיות, כגון 24 עור 25 מוח. אנחנו מעדיפים לבודד תאים בודדים על ידי מיקרו אספירציות שכן היא מאפשרת FO r הערכה חזותית של כל תא כדי להיות רצף. עם זאת, אפשר גם לבודד תאים בודדים ידי מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) 26 והתקני microfluidic 27. אם בידוד תא יחיד הגברה הגנום כולו מתבצע באופן ידני, סביר לבודד להגביר עד תאים ארבעים אחד יושב. על מנת לקבל נתוני רצף תא בודד באיכות גבוהה, חשוב כי ההגברה של הגנום תא בודד היא אחידה ושלמה. אנו מוצאים כי איכות יחיד תאים המבודדות כמו גם את היעילות של תמוגה יש הגברת השפעה משמעותית על איכות נתוני רצף. ככזה, יש לקצור את התאים מן סביבת מולדתם רק לפני הבידוד והגברת הגנום כולו צריך להתחיל מייד לאחר תאים מבודדים. יתר על כן, צעד תמוגה והפיצול יש לפעול בדיוק כפי שמתואר בשלבי 2.3-2.6.
"> האלגוריתמים יכול להיות מותאם כדי לשנות את הרזולוציה של זיהוי CNV, עם השפעות מנוגדות על הרגישות והסגוליות 12. כמו כן, ניתן להתאים את הספים כדי לזהות aneuploidy כל כרומוזום בסביבה של 11 tetraploidy. עם זאת, אנו מוצאים כי הגישה שלנו מוגבלת לגילוי CNVs יותר מ -5 Mb, כרעש הציג במהלך הגברת הגנום כולו מסבך זיהוי של וריאנטים קטן 12. שיפורים עתידיים בגישות הגברת הגנום כולו צריכים בסופו של דבר לשפר את הרזולוציה של זיהוי CNV באמצעות רצף תא בודד.רצף תא בודד מאפשר לחקירה של שינויים במספר העותק יחידים לא אבל גם וריאציות נוקלאוטיד בודדות 28, 29 ו וריאציה מבנית 30. הפרוטוקול שלנו עבור בידוד תא בודד יכול להיות מיושם לענות que אלה אחריםstions. עם זאת, הבחירה של שיטת הגברת הגנום כולו תלויה ביישום המסוים. השיטה המתוארת פרוטוקול זה, המתבסס על תגובת שרשרת פולימראז, הוא מתאים ביותר לאיתור שינויי מספר העותק כי היא מזוהה עם רמות נמוכות יותר של הטית הגברת 32. על חקירה וצורות אחרות של שינויי הגנומי, כגון פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד, שיטות אחרות של הגברת הגנום כולו הם האמינו להיות יותר מתאימים 31, 32.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סטיוארט לוין להערות על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט GM056800 ואת קאתי קורט אריחים Cancer Research הקרן אנג'ליקה עמון בחלקו על ידי P30-CA14051 גרנט תמיכה קוך המכון. אנג'ליקה עמון הוא גם חוקר של הווארד יוז רפואי במכון ואת קרן גלן Biomedical Research. קאק נתמך על ידי T32GM007753 גרנט הדרכת NIGMS.
Materials
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177 | |
| PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) | VWR | 89068-500 | |
| PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) | VWR | 89068-508 | |
| Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 um) | VWR | 28144-040 | |
| Serological pipette (5 ml) | BioExpress | P-2837-5 | Any plastic 5 mL pipette should suffice |
| In-Line Water Trap for Oxygen Use | Amazon.com | 700220210813 | |
| Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) | VWR | 34502-99 | |
| Modeling clay | VWR | 470156-850 | |
| Petri dish (150 mm diameter) | VWR | 25384-326 | Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells |
| Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates | Bio-Rad | HSS9601 | Any 96-well PCR plate should suffice |
| 96-well tissue culture plate | VWR | 62406-081 | Any 96-well tissue culture plate should suffice |
| GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit | Sigma | WGA4 | |
| Microseal 'A' Film | Bio-Rad | MSA5001 | |
| Mini plate spinner | Thomas Scientific | 1225Z37 | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1861096 | Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate |
| Agencourt Ampure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Dynamag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Any similar magnetic tube strip should suffice |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-121-1012 | |
| Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) | Kapa Biosystems | KK4845 | This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine. |
Riferimenti
- Kahlem, P. Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome. Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).
- Torres, E. M. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317 (5840), 916-924 (2007).
- Itsara, A. Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease. Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).
- Sudmant, P. H. Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation. Science. 349 (6253), aab3761 (2015).
- Navin, N. Inferring tumor progression from genomic heterogeneity. Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).
- Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases. Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).
- Yates, L. R. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).
- Forsberg, L. A. Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells. Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).
- Laurie, C. C. Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).
- Jacobs, K. B. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer. Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).
- Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).
- Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing. Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).
- . KAPA Library Quantification Kit Available from: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2016)
- . DNAcopy Available from: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html (2016)
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Navin, N. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
- Szulwach, K. E., Chen, P. Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism. PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Wang, Y. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing. Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).
- Zhang, C. Z. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).
Citazione di questo articolo
Knouse, K. A., Wu, J., Hendricks, A. Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (120), e55143, doi:10.3791/55143 (2017).