الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة
Summary
تسلسل وحيد الخلية هو أداة شعبية متزايدة ويمكن الوصول إليها لمعالجة التغيرات الجينية بدقة عالية. ونحن نقدم البروتوكول الذي يستخدم التسلسل خلية واحدة لتحديد عدد النسخ تغييرات في الخلايا وحيدة.
Abstract
الكشف عن التغيرات الجينية في قرار وحيد الخلية مهم لوصف التباين الوراثي والتطور في الأنسجة الطبيعية، والسرطانات، والسكان الميكروبية. وقد الطرق التقليدية لتقييم التباين الوراثي محدودة بسبب دقة منخفضة، انخفاض الحساسية، و / أو منخفضة النوعية. وقد برزت تسلسل خلية واحدة باعتبارها أداة قوية للكشف عن تباين وراثي مع ارتفاع القرار، وحساسية عالية، وعندما حللت بشكل مناسب، خصوصية عالية. نحن هنا نقدم بروتوكول لعزل، كامل الجينوم التضخيم، والتسلسل، وتحليل الخلايا واحد. يسمح نهجنا لتحديد موثوق للmegabase نطاق المتغيرات في عدد النسخ في زنازين انفرادية. ومع ذلك، يمكن أن تطبق أيضا جوانب من هذا البروتوكول للتحقيق في أنواع أخرى من تغيرات جينية في خلايا مفردة.
Introduction
تغييرات في عدد النسخ الحمض النووي يمكن أن تتراوح في حجمها من عدة أزواج قاعدة (عدد النسخ المتغيرات) (التنوعات في عدد النسخ) على الكروموسومات بأكملها (عدم توازن الصبغيات). تغييرات في عدد النسخ التي تؤثر على مناطق واسعة من الجينوم يمكن أن يكون لها عواقب كبيرة المظهرية عن طريق تغيير التعبير تصل إلى الآلاف من الجينات 1، 2. التنوعات في عدد النسخ التي تكون موجودة في جميع الخلايا من السكان يمكن الكشف عنها بواسطة التسلسل السائبة أو أساليب تعتمد على ميكروأري 3 و 4. ومع ذلك، يمكن السكان أيضا أن تكون متباينة وراثيا، مع التنوعات الموجودة في مجموعة فرعية من السكان أو حتى الخلايا وحيدة. تباين وراثي شائع في السرطان، والقيادة تطور الورم، وأيضا في الأنسجة الطبيعية، مع مجهولة العواقب 5، 6، 7، 8، 9 <suص>، 10.
تقليديا، تم تقييم التباين الوراثي إما عن طريق نهج سيتولوجي أو التسلسل بالجملة. النهج سيتولوجي، مثل مضان في الموقع التهجين (FISH)، وينتشر كروموسوم، وتنميط نووي الطيفي (سكاى)، لديها مصلحة تحديد التعديلات موجودة في الخلايا الفردية ولكن لديها معدلات الخطأ عالية بسبب القطع الأثرية من التهجين ونشر 11. تقتصر هذه الأساليب أيضا في عدد نسخ قرار فقط كاشفا على التغييرات تغطي العديد من megabases. التسلسل أو المجهرية من الحمض النووي بالجملة، على الرغم العالي في الدقة والقرار، هو أقل حساسية. من أجل الكشف عن التباين الوراثي من خلال النهج القائمة على السكان، يجب أن تكون المتغيرات الحالية في جزء كبير من الخلايا في عدد السكان. جعلت ظهور أساليب لتضخيم الحمض النووي الجيني من الخلايا واحد من الممكن أن تسلسل جينوم الخلايا وحيدة. seque خلية واحدةncing لديها مزايا عالية الدقة، حساسية عالية، وعندما يتم تطبيق الأساليب المناسبة لمراقبة الجودة، وارتفاع دقة 12.
هنا، نحن تصف طريقة للكشف عن megabase النطاق في عدد النسخ تغييرات في الخلايا وحيدة. نحن عزل الخلايا واحد من قبل microaspiration، تضخيم الحمض النووي الجيني باستخدام رابط محول PCR، وإعداد مكتبات للجيل المقبل من التسلسل، وكشف عدد النسخ المتغيرات من قبل كل من نموذج ماركوف الخفي وتجزئة الثنائية دائرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقليديا، وتحديد التنوعات وعدم توازن الصبغيات على مستوى الخلايا وحيدة المطلوبة طرق سيتولوجي مثل الأسماك والسماء. الآن، وقد برزت تسلسل خلية واحدة كنهج بديل لمثل هذه الأسئلة. التسلسل خلية واحدة لديها مزايا أكثر من الأسماك وSKY حيث أنها الجينوم على نطاق وعالية الدقة. وعلاوة على ذلك، عندما يتم تطبيق الأساليب المناسبة لمراقبة الجودة، والتسلسل خلية واحدة يمكن أن توفر تقييما أكثر موثوقية من التنوعات وعدم توازن الصبغيات كما أنها ليست عرضة للتهجين ونشر الأعمال الفنية الأصيلة للأسماك وSKY. ومع ذلك، فإن العديد من التطبيقات الحديثة التسلسل خلية واحدة لم يتم إثباتها عن طريق تقييم شامل للحساسية وخصوصية الطرق والتحليلات. في الواقع، وترتبط بعض المناهج التحليلية المستخدمة من قبل دراسات أخرى مع ترددات عالية (> 50٪) من CNV ايجابية كاذبة يدعو 12. النهج وصفنا وقد تم اختبار صارم باستخدام خلايا KNعبء CNV الخاصة من أجل تحديد معدلات اكتشاف الصواب والخطأ وتحسين حساسية وخصوصية كشف CNV 12. عن طريق مراقبة الجودة والأساليب التحليلية الموصوفة في هذا البروتوكول، ما يقرب من 20٪ من 5 المكاسب ميجا بايت، 75٪ من 5 خسائر ميغابايت، وجميع التنوعات تزيد عن 10 ميجا بايت يمكن الكشف عنها. على الرغم من تحديد معدل اكتشاف كاذبة التسلسل خلية واحدة أمر صعب، ونحن قد يقدر لها أن تكون أقل من 25٪. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى الخلايا من مجموعة متنوعة من المصادر، والنصوص يمكن تعديلها لضبط دقة الكشف CNV، والبروتوكول يمكن تكييفها لتحديد أنواع أخرى من التعديلات الجينوم.
وهناك مجموعة متنوعة من وسائل النأي أنسجة جديدة في زنازين انفرادية، والعديد من المنشورات يصف الإجراءات الأمثل لأنسجة معينة، مثل الجلد 24 والدماغ 25. ونحن نفضل أن عزل الخلايا واحد من قبل microaspiration لأنها تسمح FO ص التقييم البصري للكل خلية لتكون متسلسلة. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا أن عزل الخلايا واحد من قبل مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 26 وأجهزة ميكروفلويديك 27. إذا تم تنفيذ العزلة خلية واحدة وكله الجينوم التضخيم يدويا، فمن المعقول أن عزل وتضخيم ما يصل إلى أربعين الخلايا في جلسة واحدة. من أجل الحصول على بيانات خلية واحدة تسلسل جودة عالية، فمن الأهمية بمكان أن التضخيم من الجينوم خلية واحدة غير موحدة وكاملة. نجد أن نوعية الخلايا وحيدة معزولة فضلا عن كفاءة تحلل والتضخيم لديها تأثير كبير على نوعية البيانات التسلسل. على هذا النحو، ينبغي أن تحصد الخلايا من بيئتها المحلية قبيل عزل وكامل الجينوم التضخيم ينبغي أن تبدأ على الفور بعد أن يتم عزل الخلايا. وعلاوة على ذلك، ينبغي اتباع خطوة تحلل وتفتت بالضبط كما هو موضح في 2،3-2،6 الخطوات.
"> والخوارزميات يمكن تعديلها لتغيير دقة الكشف CNV، مع معارضة تأثيرات على حساسية وخصوصية (12). ومن الممكن أيضا لضبط عتبات للكشف عن كامل الكروموسوم عدم توازن الصبغيات في تحديد الرباعي (11). ومع ذلك، نجد أن يقتصر مقاربتنا للكشف عن التنوعات أكبر من 5 ميغابايت، كما الضجيج قدم خلال كامل الجينوم التضخيم يعقد الكشف عن المتغيرات أصغر 12. يجب أن التحسينات المستقبلية في النهج الجينوم التضخيم كلها تعزز في نهاية المطاف قرار الكشف CNV باستخدام التسلسل خلية واحدة.التسلسل خلية واحدة يسمح للتحقيق ليس فقط للتغييرات في عدد النسخ ولكن أيضا اختلافات النووية المنفردة 28 و 29 و التباين الهيكلي 30. بروتوكول لدينا لعزل خلية واحدة يمكن تطبيقها على الإجابة على هذه كيو الآخرينstions. ومع ذلك، واختيار كامل طريقة الجينوم التضخيم يعتمد على تطبيق معين. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول، الذي يقوم على تفاعل البلمرة المتسلسل، هو الانسب للكشف عن تغييرات في عدد النسخ لأنه يرتبط مع انخفاض مستويات التضخيم التحيز 32. للتحقيق في أنواع أخرى من التعديلات الجينومية، مثل النوكليوتيدات المفردة، ويعتقد أن أساليب أخرى لكامل الجينوم التضخيم لتكون أكثر ملاءمة 31، 32.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ستيوارت ليفين للتعليقات على هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM056800 وكاثي وصندوق أبحاث السرطان كيرت الرخام لانجيليكا آمون والجزء الآخر من معهد كوخ منحة دعم P30-CA14051. أنجيليكا آمون هو أيضا محقق من معهد هوارد هيوز الطبي ومؤسسة جلين للبحوث الطبية الحيوية. ويدعم كاك من المنحة T32GM007753 NIGMS التدريب.
Materials
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177 | |
| PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) | VWR | 89068-500 | |
| PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) | VWR | 89068-508 | |
| Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 um) | VWR | 28144-040 | |
| Serological pipette (5 ml) | BioExpress | P-2837-5 | Any plastic 5 mL pipette should suffice |
| In-Line Water Trap for Oxygen Use | Amazon.com | 700220210813 | |
| Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) | VWR | 34502-99 | |
| Modeling clay | VWR | 470156-850 | |
| Petri dish (150 mm diameter) | VWR | 25384-326 | Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells |
| Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates | Bio-Rad | HSS9601 | Any 96-well PCR plate should suffice |
| 96-well tissue culture plate | VWR | 62406-081 | Any 96-well tissue culture plate should suffice |
| GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit | Sigma | WGA4 | |
| Microseal 'A' Film | Bio-Rad | MSA5001 | |
| Mini plate spinner | Thomas Scientific | 1225Z37 | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1861096 | Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate |
| Agencourt Ampure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Dynamag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Any similar magnetic tube strip should suffice |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-121-1012 | |
| Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) | Kapa Biosystems | KK4845 | This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine. |
Riferimenti
- Kahlem, P. Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome. Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).
- Torres, E. M. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317 (5840), 916-924 (2007).
- Itsara, A. Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease. Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).
- Sudmant, P. H. Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation. Science. 349 (6253), aab3761 (2015).
- Navin, N. Inferring tumor progression from genomic heterogeneity. Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).
- Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases. Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).
- Yates, L. R. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).
- Forsberg, L. A. Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells. Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).
- Laurie, C. C. Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).
- Jacobs, K. B. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer. Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).
- Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).
- Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing. Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).
- . KAPA Library Quantification Kit Available from: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2016)
- . DNAcopy Available from: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html (2016)
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Navin, N. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
- Szulwach, K. E., Chen, P. Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism. PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Wang, Y. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing. Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).
- Zhang, C. Z. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).
