In Vitro Differentiatie van Mature spiervezels voor Live Imaging

LET OP: Een muis opbrengsten voldoende myoblasten voor ongeveer twee 35 mm gerechten of twee live-imaging gerechten, dus plan matten, dissectie en coating (stap 2.6) dienovereenkomstig. Sinds myoblasten zijn geïsoleerd door middel van sequentiële centrifugeren en preplating, moet het protocol worden uitgevoerd in batches van 5-10 dieren. Alle procedures waarbij proefdieren werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee bij Instituto de Medicina Moleculaire en de Universiteit Pierre et Marie Curie 1. Dissectie van pasgeboren muizen Hind ledematen Spieren Bereid alle oplossingen van tevoren (Materialen Table) en steriliseer door middel van filtratie (0,22 pm filter). Of alle media bij 37 ° C vóór toevoeging aan de cellen, behalve de formuleringen die basaalmembraan matrix (bijv Matrigel). Steriliseer de dissectie materiaal (een van elk van: gebogen schaar, rechte schaar, gewone pincet,en fine-tip pincet) en de werkbank door ze af te vegen met 70% ethanol. Bereid een 100 mm petrischaal met 5 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) voor spier verzamelen en houden op ijs tot het hakken stap. Onthoofden P6 – P8 muizen met rechte schaar en steriliseren de huid met 70% ethanol. Maak een insnijding in de rug huid en trek het voorzichtig in de richting van de achterste ledematen, totdat het wordt verwijderd, volledig bloot de achterpoten ledematen spiermassa. Gebruik de tang om vetweefsel te verwijderen zonder beschadiging van de spieren. Om de dorsale achterste ledematen spieren te verwijderen, houdt het been gestrekt en buig de poot aan de hiel pezen bloot te leggen. Gebruik de gebogen schaar om aparte spier uit het bot, uitgaande van de pezen, door zachtjes te schuiven en naar boven te snijden. Accijnzen de spieren en plaats ze in ijskoude DPBS. Isoleer de quadriceps door afklemmen van de spier met fijne punt pincet en snijden rond het zonder beschadiging van de femur of het kniegewricht. Na het ontleden van alle dieren, ga dan naar een steriele laminaire stroming celkweek kap, waar alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd. 2. myoblast Isolation Verwijder de overmaat aan DPBS. Hak het weefsel met gesteriliseerd gebogen schaar om een ​​massa te verkrijgen. Verzamel de gehakt weefsel in een 50 ml conische centrifugebuis via 5 ml digestie mix en incubeer met agitatie bij 37 ° C gedurende 90 min. Stop de digestie door het toevoegen van 6 ml dissectie medium en centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 75 xg het restmateriaal pelleteren. het verzamelen van de supernatant voorzichtig. Zorg ervoor dat u niet het verzamelen van weefsel puin. Centrifugeer bij 350 xg gedurende 5 minuten; hersuspenderen in 5 ml dissectie medium. Filter de celsuspensie door een 40 um cel zeef. Voeg 25 ml dissectie medium en preplate in een 150 mm schaal van 4 uur in een celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2 </ Sub>) om de fibroblasten te houden. Terwijl preplating, laag gerechten met 500 pi van basaalmembraan matrix verdund 1: 100 in IMDM koude gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was eenmaal met DPBS en onmiddellijk het bord van de cellen (stap 2.8) of verlaten met groeimedium tot plating. Na preplating, verzamel de supernatant en Centrifugeer bij 350 xg gedurende 10 min. Resuspendeer in groeimedium en tel de cellen op een hemocytometer. Stel het volume zo dat er tussen de 150.000 en 250.000 cellen worden uitgeplaat per basaal membraan-matrix gecoate schaal. Houd de cellen in een celkweek incubator. 3. myofiber Differentiatie Opmerking: Na 3 d, moeten de cellen beginnen te smelten en vormen myotubes bij ongeveer 70% confluentie (Figuur 1B). Op dit punt transfecteren van de cellen, indien gewenst, met een siRNA of DNA van belang. Als de cellen niet te transfecteren, verandert direct naar differentiatiemedium en skip naar stap 3,4. Transfecteren met transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer de cellen gedurende 5 uur met siRNA-lipidecomplexen (20 nM + 1 pi reagens) of DNA-lipidecomplexen (1 ug + 1 pi reagens). Optimaliseren van de siRNA en DNA concentraties indien nodig. Was ze eenmaal met differentiatie medium en dan overschakelen naar nieuwe differentiatie medium. De volgende dag verdunnen basaalmembraan matrix 1: 2 in ijskoude differentiatiemedium. Verwijder de bestaande medium en voeg 200 ul ijskoude matrix elk gerecht. Incubeer gedurende 30 min in een celkweek incubator. Supplement de differentiatie medium met agrine (100 ng / ml) en voorzichtig 2 ml aan de cellen. Zorgvuldig wijzigen helft van het medium elke 2 d, altijd vullen met agrine tot een uiteindelijke concentratie van 100 ng / ul. Monitor celdifferentiatie en de levensvatbaarheid. Afhankelijk van een aantal factoren (zoals FBS en cHicken embryo extract oorsprong), de cellen zou kunnen nemen tussen 5-10 differentiatie d tot volle rijping (Figuur 2) te bereiken. 4. Immunokleuring in Glas-bottom Dishes Voor immunokleuring op elk tijdpunt plaats, was de cellen één keer met DPBS en bevestig ze met 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Was ze tweemaal met DPBS. Op dit punt kunnen de cellen worden opgeslagen bij 4 ° C. Doorlaatbaar ze met 0,5% Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was ze tweemaal met PBS en geblokkeerd met blokkeeroplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer ze met primair antilichaam verdund in blokkeeroplossing O / N bij 4 ° C. 3x wassen met DPBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer ze met het secundaire antilichaam en 0,2 ug / ml DAPI gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. 3x wassen met DPBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 200 ul van fixeermiddel en overgaan tot beeldvorming.