في المختبر تمايز الناضجة Myofibers للتصوير لايف
Summary
Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.
Abstract
وتتكون العضلات والهيكل العظمي من myofibers، أكبر الخلايا في جسم الثدييات واحدة من عدد قليل من syncytia. كيف يتم تجميع الهياكل المعقدة والحفظ تطويريا التي يتكون منها لا يزال قيد التحقيق. حجمها والفسيولوجية ملامح غالبا ما تقيد التلاعب والتصوير التطبيقات. ويستخدم على نطاق واسع الثقافة من خطوط الخلايا خلده، ولكن يمكن تكرار سوى الخطوات الأولى من التمايز.
هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يتيح التلاعب الجيني سهولة myofibers القادمة من myoblasts الماوس الأولية. بعد أسبوع واحد من التمايز، وmyofibers عرض انقباض، محاذاة ساركومير والثلاثيات، وكذلك نوى الطرفية. يمكن أن يتبع عملية التمايز بأكملها من خلال التصوير الحي أو المناعي. هذا النظام يجمع بين مزايا الموجودة خارج الحي وفي بروتوكولات المختبر. إمكانية ترنسفكأيشن سهلة وفعالة وكذلكسهولة الوصول إلى جميع مراحل التمايز يوسع التطبيقات المحتملة. Myofibers بالتالي، يمكن استخدامها ليس فقط لمعالجة مسائل البيولوجيا التطورية والخلية ذات الصلة، ولكن أيضا لإعادة إنتاج الظواهر مرض في العضلات لالتطبيقات السريرية.
Introduction
الهيكل العظمي والعضلات يؤلف ما يصل إلى 40٪ من وزن جسم الإنسان 1. وتمثل الاضطرابات المرتبطة عضلة الصحية الهائلة والعبء الاقتصادي 2. كيف يتكون هذا النسيج المعقد للغاية والمنظمة، حافظ، ومجدد يشكل حقل بحث واسعة وراسخة. تبعا لأهمية علمية محددة، يمكن أن النهج الأكثر ملاءمة تتراوح بين الثقافات myotube مركزيا بسيطة لمجمع في النماذج الحية 3-6.
والهدف من هذا البروتوكول هو توفير نظام في المختبر التي تسمح لرصد تكون العضل من خلال التصوير الحي والمناعي. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، وهذا النظام يوفر نظرة كاملة جدا وحيوية في عملية عضلي الماوس. يمكن اتباعها الخلايا من مرحلة بالخلايا العضلية الجذعية إلى ناضجة، ليف عضلي متعددة النوى عرض الثلاثيات متقاطع ونوى الطرفية 7. هذا المستوى النضج يمكنيمكن تحقيقه باستخدام معدات زراعة الخلايا العادية، دون الحاجة إلى أجهزة تنشيطية أو الميكانيكية المعقدة. وعلى الرغم من بعض النجاح في أنظمة المختبر تم الإبلاغ 8،9، على حد علمنا، هذا هو البروتوكول الوحيد توليد myofibers الماوس ناضجة مع تي الأنابيب يقترن عرضيا مع العضلية شبكية (SR). وبالتالي، فإن هذا النظام في المختبر يمكن أن تستخدم لدراسة الآليات الجزيئية لتشكيل الثالوث، التي لا تزال غير مفهومة 10.
وثمة ميزة أخرى لاستخدام هذا النظام هو توافر الموارد المستهدفة الماوس التحقق من صحتها، مثل الأجسام المضادة، والأدوية، والأدوات رني. لا يتطلب بروتوكول بسيط نسبيا خطوات شاقة، والتلاعب من ذوي المهارات العالية، أو معدات باهظة الثمن ومخصصة. تبدأ myofibers نضجت تظهر بعد 5 د للثقافة التمايز 7، وعرض انقباض جانب الشرر الكالسيوم (بيانات غير منشورة). في أسبوع واحد، وتطوير مختلفآل مراحل إحدى الخلايا الأكثر تعقيدا في جسم الثدييات يمكن دراستها بالاشتراك مع مجموعة متنوعة من فحوصات في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام هذا البروتوكول لزراعة myoblasts الأولية يثير مكانة خاصة التي تغذي بشكل كبير في تطوير myofibers. ومن المقرر جزئيا إلى أنواع أخرى من الخلايا التي هي أيضا موجودة بأعداد قليلة جدا هذا. يجب تحقيق التوازن بين تركيز بالخلايا العضلية الجذعية ونقاء الثقافة. يعتمد ثقافة خلية جيدة أيضا على نوعية المنتجات المستخدمة لصياغة المتوسطة. جميع المنتجات المشتقة من مصادر حيوانية يجب اختبارها بدقة. في تجربتنا، وينبغي أيضا أن تراقب الأوضاع الهضم.
كالعادة للثقافات الأولية، يمكن أن تقلب التجريبية تكون أعلى مما كانت عليه في الدراسات مع الألياف معزولة أو myoblasts خلد. هذا التغير يمكن أن تقلص من توحيد مكونات المتوسطة والهضم، والفئران العمر والحجم، والنقاط الزمنية للتلاعب الثقافة وجمع النتائج. ومع ذلك، والاستفادة من التدقيق في الوقت الحقيقي آليات معقدةاللازمة لنمو ليف عضلي يفوق كثيرا من العيب التباين.
هذا البروتوكول يمنح مزايا في المختبر النهج دون المساس تمايز الخلايا. تنضج Myofibers حتى تتشكل الثلاثيات وتقترن تقلصات إلى الشرر الكالسيوم. هذه المخرجات الوظيفية يمكن الوصول إليها في ظروف تجريبية مختلفة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون هناك العديد من الاختلافات التقنية التي أدخلت على البروتوكول. Myoblasts يمكن أن تحصد من الفئران حديثي الولادة مع الطفرات المصالح المتعلقة تنمية العضلات. الخلايا يمكن هي lysed لتحليل الكيمياء الحيوية في مختلف نقاط وقت التمايز. يمكن إضافة المؤشرات الكالسيوم للثقافة لمتابعة دينامياتها. بنيات علم البصريات الوراثي يمكن استخدامها لتنفيذ بعض مسارات الإشارات أو للحث على الاستجابات المحلية المحددة. وأخيرا، فإن myofibers يمكن cocultured مع أنواع الخلايا الأخرى لدراسة تفاعلاتها.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Fundação para a Ciência e Tecnologia (MP).
Materials
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
| IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
| Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be <1.5 |
| Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
| Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
| Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Fetal Bovine Serum | Eurobio | CVFSVF0001 | |
| Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
| Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200ng/ul |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and Media | |||
| Digestion Mix | in DPBS 5 mg/ml collagenase 3.5 mg/ml dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
| Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |
Riferimenti
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
- Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases. Front Physiol. 5, 37 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J Vis Exp. (73), (2013).
- Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J Vis Exp. (106), (2015).
- Falcone, S., Roman, W., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2. J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).
- Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression. Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).
- Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skelet Muscle. 1, 26 (2011).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. , (2016).
- Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS. Sci Rep. 6, 27804 (2016).
