Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

Sanger sequenziamento è stato tradizionalmente il gold standard in fase di test per entrambi noti e sconosciuti mutazioni somatiche. Uno dei limiti di sequenziamento Sanger è il suo limite di rilevabilità (~ 10 – 20% allele mutante in un contesto di WT) ^1. Questo livello di sensibilità è appropriato per rivelare mutazioni somatiche basso livello che possono essere presenti nei campioni di tessuti precancerose o pazienti con poche cellule tumorali circolanti, o quando midollo osseo (BM) è irregolare. Questo rende anche valutare malattia residua dopo la terapia o la rilevazione di mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia difficile mediante sequenziamento convenzionale solo ^2. Sostituendo PCR convenzionale con acido nucleico bloccato (LNA) mediata wild-type blocco PCR (WTB-PCR) in Sanger sequenziamento, sensibilità fino allo 0,1% allele mutante in uno sfondo di WT può essere raggiunto ^{2, 3, 4.} InWTB-PCR, arricchimento per alleli mutanti è ottenuta tramite l'aggiunta di una breve (~ 10 – 14 NT) blocco (LNA) oligonucleotide che si lega preferenzialmente WT DNA impedendo così l'amplificazione del DNA WT. Il prodotto WTB-PCR arricchito mutante può quindi essere sequenziato. Bloccando WT DNA piuttosto che selezionare per mutazioni specifiche WTB-PCR permette l'arricchimento di entrambe le mutazioni conosciute e non presenti nelle frazioni cellulari minute.

Più metodi attualmente utilizzati per la rilevazione di mutazioni in piccole celle frazioni. Questo include PCR, amplificazione refrattaria sistema allele-specifica mutazione (ARMS), denaturazione cromatografia liquida ad alta prestazione (DHPLC), perline, emulsioni, amplificazione, e magnetismo (raggiante), rilascio indotta dal campo elettrico e misura (Efirm), alta risoluzione punto di fusione e altri. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono limitati dai falsi positivi e la capacità di rilevare solo una mutazione che il test è stato progettato per ⁴ </sup>. WTB-PCR, tuttavia, consente all'utente di visualizzare tracce di sequenziamento che consente il rilevamento di diversi tipi di mutazione e può aiutare a escludere falsi positivi dovuti ad artefatti o eventi deaminazione. sequenziamento di prossima generazione (NGS) può offrire una valida alternativa al sequenziamento convenzionale, tuttavia, sostanzialmente maggiori costi, complessità e tempo saggio più rendono un'opzione inutile per molti tipi di malattie con poche marcatori molecolari distinti o per il monitoraggio di pazienti in terapia per emergenti mutazioni di resistenza. Inoltre, elevati tassi di falsi positivi al rilevamento varianti con frequenze alleliche mutanti inferiori al 5% possono rappresentare un problema per NGS ampliconi basati ^{5, 6.}

Qui mostriamo l'aumento della sensibilità raggiunto da WTB-PCR in screening per mutazioni nel differenziamento mieloide fattore di 88 geni come descritto da Albitar et al. ³ MYD88 mutations sono importanti fattori diagnostici e prognostici in Macroglobulinemia di Waldenström (WM), IgM gammopatia monoclonale di significato sconosciuto (IgM MGUS), della milza linfoma della zona marginale (SMZL), e linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL). mutazioni MYD88 si trovano in quasi tutti i casi di WM e circa il 50% dei pazienti con immunoglobuline M (IgM) -secernenti MGUS. Contrastingly, mutazioni MyD88 si trovano solo 0-6% dei pazienti con SMZL e sono assenti nel mieloma multiplo ^{7, 8.} Poiché morfologica sovrapposte, immunofenotipica, citogenetica, e caratteristiche cliniche tra WM e SMZL o mieloma multiplo IgM spesso può complicare diagnosi differenziale, la presenza di una mutazione MYD88 può servire come un fattore che identifica utile ^9. Mutazioni MYD88 sono stati associati con una maggiore carico di malattia nei pazienti con DLBCL e la scarsa sopravvivenza globale dopo la terapia ^7, </sup> ^10. Inoltre, poiché le mutazioni MYD88 sono più frequentemente trovati in attivo (ABC) DLBCL B-cell-like di centro germinale B-cell-like (GCB) DLBCL o linfoma primario del mediastino cellule B (PMBL), MYD88 stato mutazionale può servire come marker surrogato per il sottotipo ABC ^{11, 12.}

Il protocollo dettagliato qui fornito serve come modello da cui nuovi saggi possono essere sviluppati o maggior saggi sequenziamento esistenti possono essere facilmente adattati per rilevare accuratamente mutazioni a bassa frequenza in vari tipi di campioni. L'approccio può essere utilizzato anche per monitorare e rilevare mutazioni resistenti che possono svilupparsi nei tumori o anche batteri che possono svilupparsi mentre i pazienti sono stati trattati con la terapia mirata o antibiotici. Inoltre, si rivolge e rimedi molti dei problemi connessi con l'arricchimento di mutazione, in particolare nel tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE).