Производство и введения терапевтических мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (MSC) Spheroids грунтованный в 3-D культур Под Зенона свободных условиях

Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), показали большой потенциал для различных регенеративных подходов медицины. МСК были первоначально выделены в виде стромального компонента костного мозга , но с тех пор были получены от многих других тканях взрослого организма, в том числе жировой ткани ^{1, 2, 3.} Интересно отметить, что основной способ изоляции включает замечательное свойство ПКЦ, чтобы плотно прилипать на тканевой культуры, пластика в присутствии эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Хотя этот традиционный метод выделения позволяет легко и быстрое расширение MSCs в двумерной (2D) культуры, это также очень искусственным и не принимает во внимание значение нативной трехмерной (3D) окружающей среды , ведущие к потенциальной потере важных клеточных характеристик ^{4, 5 , 6.} Таким образом, изучение MSCs в 3D культур, которыйявляются более физиологичным, чем традиционные 2D культур, возникла в поисках «потерянных / заниженных" MSC характеристик. Кроме того, большой интерес поднялся, чтобы идентифицировать Xeno свободных (XF) химически определенные условия для MSC культуры и активации, и таким образом сделать клетки более податливыми для клинического применения.

Многие исследования были опубликованы демонстрации 3D культуры ПКЦ как в биоматериалов и в виде сферических агрегатов или сфероидов. MSCs в биоматериалов первоначально были разработаны для тканевой инженерии подходы для замены поврежденных тканей с сотовыми посеяны каркасах, в то время как сфероида культуры MSCs рассматривались как способ понять поведение MSC в естественных условиях после введения клеток для терапии в доклинических или клинических испытаний ^{4, 5, 7.} Интересно, что MSCs форма сфероидов спонтанно, когда присоединение к культуре ткани пластика не допускается^{8, 9, 10.} Традиционно агрегация клеток облегчается с помощью методов колбах центрифужных или жидких методов наложения, методы, используемые первоначально в биологии рака в усилиях, чтобы попытаться имитировать микроокружение опухоли. В последнее время , дополнительные методы всплыли , которые демонстрируют агрегацию клеток в культуральные чашки , предварительно покрытые конкретными химическими веществами , чтобы предотвратить клетки к пластический адгезии ^{4, 5, 6.} Один из самых простых и экономичных методов для генерации MSC сфероидов к культуре их в висячей капли, метод, который часто используется для получения эмбриональных телец из эмбриональных стволовых клеток. С свисающими технику культуры, прилипание клеток к культуре ткани пластика предотвращается путем суспендирования клеток в капле среды на нижней стороне ткани культуры блюдо крышкой и позволяя тяжести, чтобы облегчить клеточную AGGREGвания в вершине капли. Размер сфероид можно легко манипулировать с помощью изменения концентрации клеток или объема капли, что делает свисающими культур особенно легко контролировать.

В ранних исследованиях на 3D культуры ПКЦ продемонстрировали радикальные различия в характеристиках клеток в 3D по сравнению с их аналогами 2D ^{6, 8, 9.} В то же время, отчеты показали , что благотворное воздействие MSCs в естественных условиях полагались на их способности активируются с помощью микро-сигналы окружающей среды и, в ответ, чтобы произвести противовоспалительное и иммуномодулирующее факторы ^11. Интересно отметить, что многие из этих факторов, таких как простагландин Е2 (PGE2), фактор некроза опухоли-стимулированной гена 6 (TSG6) и фактор роста гепатоцитов (HGF) были произведены в гораздо больших количествах MSC сфероидов, чем традиционные 2D MSCs прокладывают путь для Идеяс использованием 3D культур , чтобы активировать клетки ^{8, 12, 13.} Кроме того, активация генов в 3D культурах появились перепросматривать механизмы, по крайней мере частично, активации клеток после инъекции в мышей ^12. При активации MSCs до их использования в экспериментах эффекты клеток может быть продлен и более заметным , как традиционный MSC эффект в естественных условиях часто задерживается и переходных процессов , и может быть описана как "хит и запустить". В течение последних нескольких лет, важные функциональные исследования с использованием MSC сфероиды, показали , что они могут подавлять воспалительные реакции и модулирования иммунитета в естественных условиях, оказывая влияние на эффекторные клетки , такие как макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы и Т – клеток , что делает сфероидов привлекательной формой загрунтованных ПКЦ ; ^{2 , 3.} Кроме того, производство молекул противораковых, таких как Interleukin-24 (ИЛ-24) и фактор некроза опухолей , связанных с апоптозиндуцирующая лиганд (TRAIL), увеличены в 3D культурах ПКЦ по отношению к монослойный MSCs, явление , которое может быть использовано для целенаправленной терапии рака ^{8, 10, 14.}

В соответствии с требованием не только использование тканевой культуры пластика, но и FBS традиционная культура MSC, еще одно препятствие, чтобы сделать MSC сфероиды более пригодным для клинического применения было необходимо преодолеть. Для решения этого препятствия, мы недавно показали образование MSC сфероидов при определенных химически определенных условиях и XF установлено , что в результате MSC сфероиды были активированы для получения тех же молекул противовоспалительными и противораковыми как сфероидов , генерируемых в условиях с FBS ^14. Здесь эти результаты представлены в нескольких детальных протоколов, которые демонстрируют генерацию предварительно активированных MSCs в 3D культур с использованием XFСМИ. Кроме того, протоколы представлены, которые описывают эффективные способы оценки уровней активация MSCs в отношении их противовоспалительными, иммуномодулирующими и противораковым действием, вместе с практическим способом доставить неповрежденные сфероидов в мышей.