Produção e Administração de Therapeutic-tronco mesenquimais / celular estromal (MSC) Spheroids condicionadas em culturas 3-D Sob Condições Xeno-livres

-Tronco mesenquimais / células do estroma (CTM) têm mostrado grande potencial para várias abordagens de medicina regenerativa. MSCs foram inicialmente isolado como um componente do estroma de medula óssea, mas uma vez que foram obtidos a partir de numerosos outros tecidos adultos, incluindo o tecido adiposo ^{1, 2, 3.} Curiosamente, o método de isolamento principal abraça a propriedade notável de MSCs de aderir firmemente ao plástico de cultura de tecidos na presença de soro fetal de bovino (FBS). Embora esta técnica de isolamento tradicional permite a expansão fácil e rápida das MSCs em bidimensional cultura (2D), é também muito artificial e ignora significado do ambiente nativo tridimensional (3D), conduzindo a potencial perda de importantes características celular ^{4, 5 , 6.} Por conseguinte, o estudo das MSCs em culturas 3D, quesão mais fisiológica do que as culturas 2D tradicionais, surgiu na pesquisa "perdidos / diminuídas" características MSC. Além disso, grande interesse tem aumentado para identificar as condições (XF) livre de xeno química definida para a cultura MSC e ativação, e, assim, tornar as células mais favorável para aplicações clínicas.

Muitos estudos têm sido publicados demonstrando a cultura 3D de MSCs, tanto em biomateriais e como agregados esféricos ou esferóides. MSCs em biomateriais foram inicialmente concebidos para abordagens de engenharia de tecidos para substituir tecidos danificados com andaimes de células-semeado, enquanto culturas esferóides de MSCs foram vistos como uma maneira de entender o comportamento MSC in vivo após a administração das células para terapias em ensaios pré-clínicos ou clínicos ^{4, 5, 7.} Curiosamente, MSCs formulário esferóides espontaneamente quando a adesão ao plástico de cultura de tecidos não é permitido^{8, 9, 10.} Tradicionalmente, a agregação de células foi facilitada por métodos balão rotativo ou técnicas de sobreposição de líquidos, os métodos utilizados inicialmente na biologia do cancro nos esforços para tentar imitar o microambiente do tumor. Mais recentemente, métodos adicionais vieram à tona que demonstram a agregação de células em placas de cultura pré-revestidas com produtos químicos específicos para evitar a célula-a-plástico aderência ^{4, 5, 6.} Um dos métodos mais simples e mais económica de produção esferóides MSC é a cultura deles em gotas de suspensão, uma técnica que foi usado frequentemente para produzir corpos embrióides a partir de células estaminais embrionárias. Com pendurado técnica de cultura gota, a adesão de células ao plástico de cultura de tecidos é evitada suspendendo as células numa gota de meio no lado inferior de uma tampa do prato de cultura de tecidos e permitindo que a gravidade para facilitar AGGREG célulação no ápice da gota. O tamanho do esferóide pode ser facilmente manipulada alterando a concentração de células ou o volume da gota, fazendo culturas de suspensão gota particularmente fácil de controlar.

Os primeiros estudos sobre a cultura 3D de MSCs demonstraram diferenças radicais nas características das células em 3D, em comparação com os seus homólogos 2D ^{6, 8, 9.} Ao mesmo tempo, relatórios demonstraram que os efeitos benéficos de MSCs in vivo confiou na sua capacidade de se tornar activado por estímulos micro-ambientais e, em resposta, para produzir anti-inflamatória e imunomodulatória Factores ^11. Interessantemente, muitos destes factores, tais como a prostaglandina E2 (PGE2), necrose tumoral gene estimulada por factor de 6 (TSG6), e factor de crescimento de hepatócitos (HGF) foi produzido em quantidades muito maiores por esferóides MSC do que as MSCs 2D tradicionais, abrindo o caminho para a ideia deutilizando culturas 3D para activar as células ^{8, 12, 13.} Além disso, a activação de genes em culturas 3D apareceu recapitular mecanismos, pelo menos em parte, da activação das células após injecção em ratinhos ^12. Ao activar as MSCs antes da sua utilização nas experiências, os efeitos das células poderia ser prolongada e mais proeminente como o efeito MSC tradicional in vivo é frequentemente adiada e transiente, e pode ser descrito como "bater e correr". Durante os últimos anos, estudos funcionais importantes que utilizam esferóides MSC demonstraram que eles podem suprimir as respostas inflamatórias e modular a imunidade in vivo, influenciando as células efectoras, tais como macrófagos, células dendríticas, neutrófilos e células T fazendo esferóides de forma atraente de MSCs imunizadas ^{2 , 3.} Além disso, a produção de moléculas de anti-cancro, tais como interleukin-24 (IL-24) e de necrose tumoral relacionado com o factor de indução de apoptose ligando (TRAIL), são aumentados em culturas em 3D de MSC em relação a monocamada MSCs, um fenómeno que pode ser explorada para terapias direcionadas ^{8, 10, 14.}

À medida que a cultura MSC tradicional necessário não apenas a utilização de plástico de cultura de tecidos, mas também de FBS, um outro obstáculo para fazer esferóides MSC mais favorável para utilização clínica tiveram que ser superados. Para enfrentar este obstáculo, que recentemente mostrou a formação de esferóides MSC em condições específicas XF química definida e estabeleceu que os esferóides MSC resultantes foram ativados para produzirem as mesmas moléculas anti-inflamatórias e anti-câncer como os esferóides gerados em condições com FBS ^14. Aqui, estes resultados são apresentados em vários protocolos detalhados que demonstram a geração de MSCs pré-activada em culturas 3D usando XFmeios de comunicação. Além disso, os protocolos são apresentados que descrevem modos eficazes para avaliar os níveis de activação das MSCs no que diz respeito aos seus efeitos anti-inflamatório, imunomoduladores e anti-cancro, em conjunto com um método prático para entregar os esferóides intactas em ratos.