Un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents Rongeurs pour évaluer Efficacité antibactérienne contre<i> S. pneumoniae</i>,<i> H. influenzae</i>,<i> K. pneumoniae</i>,<em> P. aeruginosa</em> ou<em> A. baumannii</em
Summary
A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
Abstract
Efficacité des traitements antibactériens candidats doit être démontrée dans des modèles animaux d'infection dans le cadre du processus de découverte et de développement, de préférence dans des modèles qui imitent l'indication clinique prévue. Procédé pour induire des infections pulmonaires solides chez des rats et des souris immunocompétentes est décrit qui permet l'évaluation des traitements dans un modèle de pneumonie grave causée par S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae ou Acinetobacter baumannii. Les animaux sont anesthésiés et un inoculum à base de gélose est déposée dans le poumon profond par intubation intra-trachéale non chirurgicale. L'infection résulte est cohérente, reproductible et stable pendant au moins 48 heures et jusqu'à 96 heures pour la plupart des isolats. Des études avec des antibactériens commercialisés ont démontré une bonne corrélation entre l' efficacité in vivo et in vitro de la sensibilité, et la concordance entre pharmacocinétiques / pharmacodynamiques cibles déterminéesdans ce modèle et les cibles cliniquement acceptées a été observée. Bien qu'il y ait un investissement initial de temps lors de l'apprentissage de la technique, elle peut être effectuée rapidement et efficacement une fois la compétence est atteint. Les avantages du modèle comprennent l'élimination de l'exigence neutropénique, une robustesse accrue et la reproductibilité, la capacité à étudier plusieurs agents pathogènes et isole, une meilleure flexibilité dans la conception de l'étude et de l'établissement d'une infection difficile dans un hôte immunocompétent.
Introduction
L'évaluation de l'efficacité des médicaments candidats potentiels dans les modèles animaux d'infection est une composante essentielle du processus de découverte de médicaments antibactériens. Les études in vivo d'efficacité fournissent des données importantes pour toute la durée des efforts de découverte, de élucidant les relations structure-activité (SAR) et l' optimisation de série chimique de plomb à travers la détermination de pharmacocinétique-pharmacodynamique (PK / PD) caractéristiques des composés et de soutenir la sélection de dose pour la prise de décision développement clinique et l'approbation réglementaire. De nombreux modèles d'infection d'animaux sont décrites dans la littérature pour ces fins. L' un des modèles les plus courants et les plus utilisées est l'infection de la cuisse de la souris neutropénique, qui a été lancée par Aigle 1, 2 et plus tard étendu par Vogelman et Craig 3, 4. Ce modèle a été inestimable pour soutenir la détermination des seuils de sensibilité bactérienne et pour fournir des cibles PK / PD pour guider le dosage humain. Il y a beaucoup examenples où la capacité prédictive de ce modèle a été prouvé 7/4. Cependant, l'un des inconvénients du modèle d'infection de la cuisse est le manque de pertinence directe pour les infections pulmonaires. Il y a maintenant une plus grande importance sur l'adéquation entre le site de l'infection dans des modèles animaux sur le site de l'infection chez l'homme; et, par conséquent, pour étudier des composés pour le traitement de la pneumonie, il est idéal d'utiliser un modèle d'infection pulmonaire chez l'animal.
Plusieurs méthodes pour induire des infections pulmonaires chez les animaux de laboratoire ont été décrits et utilisés pour des études d'efficacité anti – bactériens , y compris par voie intranasale par inhalation, par la voie d' aspiration de l' oropharynx, l' exposition à l' aérosol et l' inoculation intra – trachéale chirurgicale 8. Dans de nombreux cas, les animaux (en particulier les souris) doivent d'abord être rendues neutropéniques afin de parvenir à une infection pulmonaire robuste. Malgré cet état sévèrement immunodéprimé, le nombre d'agents pathogènes et de souches bactériennes qui produisent des infections viables chez les rongeurs estlimité. Par exemple, il peut être difficile d'établir avec succès Haemophilus influenzae ou Acinetobacter baumannii dans les modèles de pneumonie 9, 10 et même plus virulent des agents pathogènes tels que Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae, peut poser des problèmes 11-13.
En 1991, Smith a décrit un modèle d'infection pulmonaire chez les rats sevrés immunocompétents où l' infection a été créée en instillant des bactéries directement dans les poumons par une méthode intratrachéale nonsurgical simple intubation 14. Berry et al. plus tard modifié la méthode pour infecter des souris 15. En utilisant un inoculum à base de gélose, cette technique d'inoculation provoque des infections pulmonaires solides chez les rats et les souris immunocompétentes avec S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa et Acinetobacter baumannii. Il se prête à un large éventail d'isolats, y compris ceux abritant diverses résistles déterminants de la ance et ceux qui ne produisent pas une infection viable par l'intermédiaire d'autres voies d'inoculation. Il permet également l'efficacité à déterminer chez les animaux immunocompétents, une condition qui est plus pertinent que le modèle de la souris neutropénique traditionnelle pour les populations de patients qui ne sont pas sévèrement immunodéprimés. La cohérence et la fiabilité de ce modèle à travers de multiples agents pathogènes et les isolats rend bien adapté pour les études d'efficacité antibactérienne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour une réussite optimale dans la reproduction de ce modèle d'infection, les suggestions suivantes devraient être envisagées. Virulence des nouveaux isolats peut être améliorée par passage 2 – 3 fois in vivo avant l'utilisation dans une étude. Souches bactériennes congelées doivent toujours être préparés à partir d' une source primaire -derived in vivo avec le moins de passages que possible de l'original, et regel ou réutilisation de stock décongelé est découragé. En utilisant des isolats cliniques récents récupéré des patients atteints de pneumonie, et / ou la préparation des cultures en phase de croissance log peut également aider à améliorer la mise en place de l'infection. Une dilution de cinq fois dans la gélose (par exemple 2 ml de solution saline suspension ajoutée à 8 ml de gélose) peut être utilisé au lieu de dix fois pour augmenter l'inoculum bactérien, et le volume de l' inoculum peut être ajustée en fonction de la taille de l'animal (par exemple 200 pi / animal est habituellement inoculés dans 250 g de rats). Avant l'addition de la suspension bactérienne dans la solution saléeagar – agar ( par exemple à l' étape 2.3), la densité bactérienne peut être prévue ou estimée par une inspection visuelle, des normes MacFarland ou des mesures de densité optique. Il est utile de se familiariser avec les caractéristiques in vitro de croissance pour chaque isolat avant de procéder à des expériences in vivo. La cohérence de la croissance et de la manipulation permet l'estimation la plus précise de la densité bactérienne pour tout isolat donné. des procédés microbiologiques classiques qui diffèrent de ceux décrits, tels que les médias et les homogénéisateurs de tissus de remplacement, peuvent être utilisés le cas échéant pour la préparation des inoculums et la numération des bactéries dans les tissus infectés.
Il est fortement recommandé de préparer ou de faire fondre la gélose le jour avant l'expérience et le stocker pendant une nuit dans un bain d'eau séparé réglé à 50 ° C. Cela simplifiera le processus et aider à se prémunir contre l'agar étant trop chaud au moment de l'infection. Une température de 41 – 42 ° C permet d'obtenir un bon équilibre entre entretenir cetning la gélose à l'état liquide sans être trop chaud pour la survie des bactéries à court terme. Comme une alternative possible à la gélose nutritive, la gélose noble a été utilisé avec succès dans certaines expériences. Un tube d'agar inoculum est généralement suffisant pour une expérience entière (et recommandé), mais plusieurs tubes peut être préparé pour infecter un grand nombre d'animaux (par exemple , plus de 60) ou lorsque le processus infectant prend plus de 30 – 45 min Si tubes d'inoculum multiples sont nécessaires, ajouter la suspension bactérienne saline à chaque tube d'agar comme il est nécessaire. Cela réduit le risque que la survie des bactéries et / ou remise en forme seront affectés par une exposition prolongée à une température élevée avant l'inoculation. Il convient de noter que l'utilisation de plusieurs tubes d'inoculum peuvent également nécessiter des procédures de randomisation des animaux supplémentaires. Chaque fois que possible, d'infecter tous les animaux de la même préparation de l'inoculum. Il est recommandé d'adapter la taille des expériences au niveau actuel de compétence avec le technique.
Un scientifique qualifié peut intuber et inoculer un animal en moins de 30 s et ensemencer jusqu'à 5 – 6 animaux par lot (ie avec une seringue pleine d'inoculum agar). Pour ceux apprentissage de la technique, la vitesse est importante que la gélose commencera à se solidifier; cependant, un positionnement précis de l'inoculum est plus important. Commencez avec 1 ou 2 animaux par lot, et augmentera à mesure que la technique devient plus familier. Les animaux continuent à respirer pendant l'intubation; Ainsi, la fenêtre de temps pour l'inoculation dépend de la rapidité avec laquelle l'animal récupère de l'isoflurane, qui doit être d'environ 2-3 min. Les animaux qui se réveillent au cours du processus peuvent être ré-anesthésiés et ont tenté une deuxième fois, mais il est déconseillé de le faire à plusieurs reprises. inoculation réussie au premier essai est prévu dans presque 100% des animaux une fois la compétence est atteint. A noter qu'il est plus facile d'apprendre la technique en utilisant des rats en premier lieu; les souris sont plus délicates et les plus petits aussils sont plus sujettes à un blocage avec de l'agar solidifié sinon manipulé rapidement. seringues pré-réchauffement, tubes et salins ainsi que du maintien du dispositif d'intubation sur une surface tiède (pas chaude), comme un coussin chauffant à basse température, peuvent aider à prévenir la solidification de l'agar-agar. Lors de l'apprentissage de la technique, il est également utile de mettre en pratique le positionnement correct de l'inoculum à l'aide d'un colorant de couleur foncée (par exemple, on concentre le bleu de méthylène), au lieu de la suspension bactérienne dans la gélose. Effectuer la procédure comme décrit, mais euthanasier l'animal immédiatement après l'inoculation du colorant (ne permettant pas l'animal de récupérer entre l'anesthésie et l'euthanasie). Disséquer pour déterminer où le colorant a été placé, et ajuster la technique en conséquence.
Le critère principal de ce modèle est CFU des poumons infectés. La survie est pas un bon indicateur de la charge bactérienne et ne constitue pas un critère recommandé. Pour les études d'efficacité, a suggéré le N est 5 – 6 animaux par groupe comme cela est predicted ≥1 pour détecter les différences de log 10 UFC entre les groupes d'au moins 90% de la puissance. Les animaux peuvent être infectés dans des groupes tels que les compagnons de cage restent ensemble, ou un véritable processus de randomisation peuvent être suivies. Notez que si les groupes sont affectés par cage, les groupes devraient être infectés dans un ordre aléatoire avec des contrôles de croissance de fin d'étude infectées dernière (pour confirmer que la survie bactérienne / remise en forme n'a pas été affectée par la durée de l'exposition à une température élevée dans le bain d'eau). Aucune méthode de censure de données devrait être nécessaire, et aucun sont recommandés à l'exception de la suppression immédiate de tout animal qui a été évidemment mis-inoculés au début de l'étude (avant le début de tout traitement). Les animaux qui sont euthanasiés avant la fin de l'étude devraient être échantillonnés et les résultats inclus dans l'ensemble , sauf si une raison valable d'exclusion a été identifiée de façon prospective les données (ie un événement sans rapport avec l'infection ou le traitement). report de la drogue peut affect quelques échantillons et est une considération importante pour tous les modèles in vivo d'infection. Si un composé est donnée fréquemment, à proximité du moment de l' euthanasie ou a une longue demi-vie, il peut être présent dans l'homogénat de tissu à une concentration suffisamment élevée pour continuer de tuer les bactéries ex vivo au cours du processus de dénombrement des bactéries (dilution et plaquage les échantillons ou sur les plaques d'agar pendant une nuit d'incubation). Pour éviter cela, le charbon actif et / ou un additif qui dégrade la molécule active sans léser les cellules bactériennes peuvent être ajoutés à l'échantillon avant l'homogénéisation. D'autres procédés comprennent la centrifugation des échantillons pour éliminer la majorité du composé actif (qui doit rester dans le surnageant) et en utilisant une dilution différente et le placage des systèmes pour diluer suffisamment du composé actif à une concentration non inhibitrice.
Comme en témoignent les exemples de la figure 2, ce modèle avec succès induces infections pulmonaires chez les rongeurs avec un large éventail d'organismes , y compris ceux qui ne poussent pas bien dans d' autres modèles (par exemple H. influenzae). Ces infections sont cohérentes et reproductibles, ce qui réduit la probabilité que les expériences devront être répétées en raison de l'échec du modèle et / ou de mauvaises performances avec un isolat donné. Bien que les animaux sont immunocompétent, ils sont incapables de résoudre rapidement l'infection, le cas échéant. Cela permet une plus grande souplesse dans la durée de l'étude, car de nombreux isolats de maintenir une infection par viable au moins 96 heures sans la nécessité d'injections répétées pour maintenir une neutropénie. L'avantage potentiel d'étudier l' efficacité antibactérienne chez les animaux immunocompétents a été noté précédemment 20, 21, et il est évident que, pour certains composés (par exemple oxazolidinones), les données de rongeurs non neutropéniques peuvent prédire plus précisément les objectifs de l' exposition humaine par rapport à ceux neutropénique rendu 5. L'utilitaire polyvalent de til modèle est démontré dans les figures 3 et 4 et les tableaux 1 et 2. Ces études font partie d'une grande collection de données publiées et non publiées qui a été généré avec ce modèle pour soutenir les efforts d'optimisation de plomb 16, 17, 22-24, à titre de comparaison et la confirmation de la proposition de dosage humain schémas 19, 25-29 et PK / PD caractérisation 18, 30-32 .While ce modèle est d' abord plus complexe à réaliser par rapport à la méthode intranasale par inhalation, il existe de nombreux avantages tels que décrits ci – dessus. Avec la pratique et l'utilisation de routine, les techniques devraient être simples à effectuer.
On peut noter dans certaines études que la charge bactérienne à l'inclusion était inférieure à celle généralement ciblée dans d'autres modèles d'infection pulmonaire. Cela est dû en grande partie à la dilution requise dans de la gélose et le petit volume de défi, en particulier chez la souris. Toutefois, il convient également de noterque la croissance bactérienne a été observée dans tous les cas, même lorsque la charge initiale était relativement faible. La charge bactérienne initiale de la cible est de 6 à 6,5 log 10 UFC / poumons (6,8 à 7,3 log 10 UFC / g de tissu chez des souris sur la base du poids des poumons en moyenne) ce qui correspond à des densités estimées chez les patients humains atteints de pneumonie sévère 33. Une charge initiale plus élevée peut être obtenue en concentrant davantage l'inoculum bactérien ou retarder le début de l'administration du composé pour permettre la croissance bactérienne supplémentaire; Cependant, l' augmentation de la charge de défi trop peut conduire à une maladie anormalement sévère et aiguë (c. -à mort en moins de 24 h) qui est réfractaire à tous les traitements antibactériens , indépendamment de la sensibilité. Bien que l'inoculum est d'abord placé de préférence dans le poumon gauche de l'animal, l'infection se propage généralement dans les deux poumons. maladie progressive du poumon, de la diffusion des bactéries à d'autres organes, et la morbidité éventuelle est souvent observed avec S. pneumoniae, K. pneumoniae et P. aeruginosa. Fait intéressant, les infections à H. influenzae et A. baumannii sont généralement plus contenu et conduisent rarement à la mort à l'inoculum bactérien prescrit.
Les résultats d'efficacité obtenus à partir de ce modèle ont une bonne corrélation avec les profils de sensibilité in vitro ainsi que des cibles / PD PK définies. La réduction de la charge bactérienne sont régulièrement observés pour les isolats considérés comme sensibles à l'agent testé, tandis que ceux qui présentent résistant considéré aucun changement ou la croissance bactérienne au-dessus de la ligne de base 16, 17, 19, 24-29. Des études chez le rat évaluant deux quinolones et d' un macrolide à l' aide de ce modèle ont montré que 32 la cible PK / PD requise pour un 1-log 10 de réduction de S. pneumoniae par rapport au niveau de référence en corrélation avec la cible déterminée chez des souris neutropéniques et, plus important encore , avec cibles cliniques pour pneum bactérienne d'origine communautaireonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, un nouveau mécanisme antibiotique, a été testé contre plusieurs S. pneumoniae et nécessitait une cible PK / PD similaire pour un 1-log 10 diminution de ce modèle d'infection pulmonaire 31 comme celle requise pour un 1-log 10 de réduction dans le modèle de la cuisse neutropénique 36 lorsque la pénétration du poumon a été pris en compte (données sur fichier). De même, les / cibles PD PK déterminées chez la souris pour GSK2251052 contre P. aeruginosa étaient compatibles pour la stase, 1 et 2 log 10 réductions de CFU entre ce modèle de poumon 30 et le modèle d'infection de la cuisse neutropénique lorsque la pénétration du poumon a été considéré comme 37, 38 . La corrélation avec un modèle d'infection pulmonaire neutropénique utilisant l'inoculation intranasale était pauvre; cependant, GSK2251052 n'a pas produit plus d'une réponse statique dans cette étude 38. Cela peut être attribuable à l'inoculum bactérien plus élevé, ce qui était de 8 log 10 UFC / souris par rapport à 6 log <sub> 10 UFC / souris dans la intubation cuisse neutropénique 37 et intratrachéale 30 modèles. La collecte de données telles que ce qui est essentiel pour l'analyse comparative, car il permet une comparaison directe avec des modèles et corrélation avec les données cliniques existantes pour évaluer la capacité prédictive translationnelle. Une utilisation plus répandue du poumon modèle d'infection intubation trachéale fournira des données supplémentaires pour ces types d'analyses.
Il existe plusieurs limites de ce modèle de pneumonie immunocompétent. Tout d'abord, il est pas bien adapté à l'évaluation émergence de résistance spontanée parce que l'inoculum bactérien élevé généralement requis pour des résultats d'études en trop sévère une infection. Après les tentatives pour atteindre la charge bactérienne de 7 ou 8 log 10 UFC au départ, la morbidité rapide a été observée ( à savoir les animaux deviennent moribonds en moins de 24 h) malgré un lavage complet de l'inoculum pour éliminer les toxines pré-existantes (données sur fichier). Ilpeut être possible de surmonter ce problème en utilisant de plus grands rongeurs. Les rats, les rats particulièrement lourdes (> 250 g), semblent mieux tolérer inoculums plus élevé par rapport aux souris et peuvent être adaptés à ce type d'étude. Une deuxième limitation est que l'utilisation de l'agar comme une infection-activateur peut empêcher l'utilisation du modèle pour l'évaluation de certains hôte: interactions pathogènes. On croit que l'agar fournit un point focal protégé jusqu'à l'infection est pleinement établie dans le poumon. Il est possible de livrer l'inoculum dans une solution saline plutôt que de l'agar pour aider à surmonter ce problème; cependant, il convient de noter que cela ne provoque une infection avec des isolats. Troisièmement, il y a une courbe d'apprentissage abrupte nécessaire pour devenir compétent dans la technique. La procédure peut être délicate, en particulier chez les souris. Il est facile de placer à tort la canule métallique dans l'œsophage, et une force excessive peut conduire à la perforation soit l'œsophage ou la trachée. le placement minutieux de l'inoculum est égalementnécessaires ou les animaux peuvent soit ne pas récupérer ou non être infectées de manière adéquate. Cependant, avec patience et persévérance, on peut devenir très compétent et effectuer la technique rapidement, en douceur et avec précision.
En supprimant l'exigence de la neutropénie, l'augmentation de la robustesse et de la reproductibilité, permettant aux enquêteurs d'étudier plusieurs agents pathogènes et les isolats, l'amélioration de la flexibilité de la conception expérimentale et en fournissant une infection difficile à caractériser la pharmacodynamie pour une pneumonie, ce modèle d'infection pulmonaire immunocompétent ajoute une valeur importante à la découverte des antibiotiques Communauté. L'utilisation accrue de ce modèle par les enquêteurs supplémentaires aidera à fournir l'étalonnage nécessaire pour lui permettre de faire accepter plus largement répandue et continuer à fournir des informations de soutien pour une interprétation appropriée.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JH souhaite remercier mentor, ami et ancien directeur Valerie Berry pour la première nous enseigne ce modèle; et Gary Woodnutt, qui nous a appris les bases de et a inspiré notre engagement dans le domaine des antibactérienne PK / PD. Tous les auteurs tiennent à remercier David Payne pour son soutien et l'appréciation de notre science. Nous tenons à remercier notre ancien dans collègues de microbiologie in vivo qui ont contribué à l'ensemble des données générées en utilisant ces méthodes, en particulier Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni page et Nerissa Simon. Enfin, nos remerciements vont à nos collègues in vitro de microbiologie pour leur aide, en particulier pour fournir toutes les CMI , nous demandons (Lynn McCloskey, Josh Ouest et Sharon Min); et pour notre équipe de microbiologie clinique qui fournit des conseils d'experts et de soutien (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman et Deborah Butler).
Materials
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
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