Abstract
候補抗菌治療の有効性は、好ましくは、意図される臨床徴候を模倣したモデルで、発見と開発プロセスの一環として、感染の動物モデルで実証されなければなりません。免疫応答性ラットとマウスで堅牢な肺感染症を誘導するための方法は、 肺炎球菌 、 インフルエンザ菌 、 緑膿菌 、 肺炎桿菌 またはA.バウマニに起因する重篤な肺炎のモデルにおける治療の評価が可能になるが記載されています。動物は麻酔し、寒天ベースの接種物は、非外科的気管内挿管を介して肺に深く堆積されます。その結果、感染は、少なくとも48時間、ほとんどの分離株の場合は最大96時間のために、一貫性のある再現可能、かつ安定しています。販売抗菌剤を用いた研究は、 インビボでの有効性との間およびin vitroの感受性に良好な相関を示しており、薬物動態/薬力学的ターゲット間の一致が決定しますこのモデルにおいて、臨床的に受け入れターゲットが観察されています。技術の学習の初期時間の投資はあるが能力が達成されると、それは、迅速かつ効率的に行うことができます。モデルの利点は、好中球減少要件の排除、増加した堅牢性と再現性、より多くの病原体と分離し、免疫適格宿主における研究デザインと挑戦的な感染の確立で改善された柔軟性を研究する能力が含まれます。
Introduction
感染の動物モデルにおける潜在的な薬物候補の有効性を評価する抗菌薬の発見プロセスの重要な要素です。 インビボでの効力研究では構造活性相関(SAR)を解明し、化合物の薬物動態・薬力学(PK / PD)特性を決定し、ための用量の選択を支援する介してリード化学シリーズを最適化することから、意思決定の発見の努力のスパン全体のための重要なデータを提供臨床開発および規制当局の承認。多数の動物感染モデルは、これらの目的のために文献に記載されています。最も一般的で広く使用されているモデルの一つはイーグル1、2によって開拓され、後にVogelmanとクレイグ3、4によって拡大された好中球減少マウス大腿感染症、です。このモデルは、細菌の感受性ブレークポイントの決意を支持するため、およびヒトの投与を導くためにPK / PDの標的を提供するための非常に貴重でした。多くの試験があります。このモデルの予測能力が4-7証明されていples。しかし、大腿感染モデルの欠点の一つは、肺感染症の直接の関連性の欠如です。ヒトでの感染部位に動物モデルでの感染部位に一致を重視が用意されました。したがって、肺炎の治療のための化合物を研究するために、動物における肺感染モデルを利用することが理想的です。
実験動物における肺感染症を誘導するためのいくつかの方法が記載され、鼻腔内、吸入、口腔咽頭経路を介して吸引、エアロゾル曝露、および外科的気管内接種8を含む抗菌有効性試験のために使用されています。多くの場合、動物(特にマウス)第堅牢な肺感染を達成するために、好中球減少レンダリングされなければなりません。この深刻な免疫不全の状態にもかかわらず、げっ歯類で実行可能な感染症を生み出す細菌病原体および株の数であります限られました。例えば、課題11-13を提起することができ、正常肺炎モデル9、10、及び例えば肺炎連鎖球菌、緑膿菌及び肺炎桿菌などのさらに多くの毒性病原体にインフルエンザ菌またはアシネトバクターバウマンニを確立することは困難です。
1991年、スミスは感染が簡単な非外科的気管内挿管法14を介して肺に直接細菌を浸透させることによって確立された免疫応答性離乳ラットにおける肺感染モデルを説明しました。ベリーら 。後にマウス15を感染させるための方法を変更しました。寒天ベースの接種物を使用して、この接種技術は、肺炎球菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、緑膿菌 とA.バウマニで両方の免疫応答性ラットとマウスで堅牢な肺感染症を誘発します。これは、様々なレジストを保有するものを含む分離株の広い範囲に適していますンスの決定および他の接種経路を介して生存可能な感染症を生じないもの。また、重度の免疫不全のではない患者集団のための伝統的な好中球減少マウスモデルよりも適切である条件、有効性は免疫応答性動物で決定することができます。複数の病原体および分離株全体でこのモデルの整合性と信頼性は、それが抗菌効力研究のために、よく最適です。
Protocol
S. pneumonie
すべての手順は、GSK制度動物実験委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従っている、と満たしているか、実験動物管理の認定のためのアメリカ協会(AAALAC)、健康と人間の米国部の基準を超えますサービスとすべてのローカルおよび連邦動物福祉に関する法律。
注:特に指定のない限り、すべての手順は、無菌技術を使用して実行する必要があります。
1.文化細菌単離
- ブロス培養は、一般的に接種するために十分な材料を提供していないとして、 肺炎球菌やインフルエンザ菌で3〜6寒天プレートを準備します。
- 標準的な微生物学的技術を用いて、-80℃での保存から冷凍保存培養を外し、完全に解凍し、ストリーク羊血液( 肺炎球菌 )を補充したトリプシン大豆寒天上にプレート当たり100μLまでまたはチョコレート寒天( インフルエンザ菌 )へ。 CO 2と5%ずに37℃で一晩インキュベートします。
- 肺炎桿菌 、 緑膿菌 またはA.バウマニにブロス培養を準備します。
- 、-80℃での保存から冷凍保存培養を外し、完全に解凍し、50mLのブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス中に株式の一定分量100μL。 (約120 rpm)で穏やかに振盪しながら37℃で一晩インキュベートします。
- [オプション]対数期培養物を希望される場合は、一定分量を50mLの新鮮なBHIブロスに生じた一晩培養物から1ミリリットル。穏やかな揺れ(約120 rpm)しながら37℃で3時間インキュベートします。
2.生理食塩水の細菌懸濁液を調製
- すべてのサスペンションの調製ステップ(2.3から2.1)の場合は、周囲の空気と37℃の間の温度で滅菌生理食塩水を利用しています。コロニーを掻き取って寒天プレートからの肺炎球菌やインフルエンザ菌の収穫一晩成長滅菌ループで表面から。濁っまで滅菌生理食塩水5mlに収穫物を移送、不透明な懸濁液が得られ、均一になるまで穏やかにボルテックスします。
- 肺炎桿菌の遠心分離機50ミリリットル、 緑膿菌または接種のために意図されたA.バウマニ最終ブロス培養( 例えば 、一晩または期培養物をログ)4500×gで5分間。ピペットで上清を除去し、廃棄します。少なくとも5 mLの滅菌生理食塩水にペレットを再懸濁し、穏やかに均質な懸濁液を達成するためにボルテックス。
- 必要であれば、さらに8~9ログ10コロニー形成単位(CFU)/ mlの範囲の密度を得るために、滅菌生理食塩水を用いて懸濁液を希釈します。 CFU / mLと決意のためにアリコートを削除します。セクション7.5および7.6に記載されているように、直列アリコートを希釈し、プレート。
3.寒天ベースの接種材料を準備します
- 栄養寒天アコーの小瓶(約50ミリリットル)を準備製造元の指示に丁かは、予め調製し、保存した固体栄養寒天のボトルを溶かします。それは約50℃に冷却させます。
- 動物が感染する手順領域に、感染プロセスのための液体寒天とすべての必要な工具および機器を運びます。エリア内に42℃に設定した小型水槽を維持します。
- 寒天は、約50℃の温度に到達することを可能にし、次いで滅菌チューブにアリコート9 mLの適切水浴に適合するようなサイズ。寒天は、約42℃に平衡化するまで、水浴中で、このチューブを残します。水は、その容器に寒天の表面を覆うが、キャップ又は蓋には触れないであろう深さであることを確認します。
- 水浴中で9 mLの寒天を含むチューブにステップ2.3から生理食塩水細菌懸濁液の1ミリリットルを追加します。チューブにキャップを、混合するために数回転倒し、水浴に戻します。
4. Anesthetize、挿管および接種動物
注: - 20計量120グラムまたは雄CD-1マウス - 100計量特定の病原体を含まない(SPF)免疫担当雄Sprague-Dawleyラット25グラムをお勧めします。食物および水を随意にすべての動物を提供し、標準的な12時間の明暗サイクルで木材チップや他の吸収性寝具に社会的にそれらを収容します。
- いずれの実験を行う前に、動物種に適したサイズの金属カニューレとポリエチレンチューブを入手し、滅菌します。滅菌1 mLの使い捨て注射器と滅菌使い捨て25ゲージの針を取得します。
注意:常にシャープコンテナにこれらの注射器や針を処分。- 1.0ミリメートルと1.0のOD - - ラット、購入または長さが約12センチである金属カニューレを製造するために、0.9のID持っている1.2ミリメートルを、その一端でおおよそ45°の角度に曲げられています。 0.4ミリメートルとOD 0.8ミリメートルのIDでポリエチレン管の11-〜12インチの長さをカット。 (を参照してください。
- マウスの場合は、#20動物の栄養チューブを購入。ペンチでそれを把握し、急激に引っ張ることにより、チューブの端からボールを削除してから、静かにおおよそ45°の角度に端を曲げます。 0.28ミリメートルとOD 0.61ミリメートルのIDでポリエチレン管の11-〜12インチの長さをカット。また、購入したガラス100μLマイクロ注射器および30ゲージ金属マイクロ注射針を滅菌します。 ( 図1Bを参照してください。)
- ガラス、スクリューキャップチューブに金属カニューレを配置し、標準的な方法によってオートクレーブ滅菌します。ソークと店はアルコールを含む覆われたビーカーにポリエチレンチューブの長さをカット。
- 1.0ミリメートルと1.0のOD - - ラット、購入または長さが約12センチである金属カニューレを製造するために、0.9のID持っている1.2ミリメートルを、その一端でおおよそ45°の角度に曲げられています。 0.4ミリメートルとOD 0.8ミリメートルのIDでポリエチレン管の11-〜12インチの長さをカット。 (を参照してください。
- 作業面と挿管装置を準備します。
- 水浴に近い、作業面上にきれいな使い捨てのマットを置きます。この表面に、そのガラスストレージ管中、金属カニューレを転送します。ストレージ管からキャップを外し、cannuの「ハンドル」の端をスライドさせ管の開放端にラ。
- 滅菌ピンセットを用いて、ビーカーからポリエチレンチューブの1の長さを除去し、滅菌金属カニューレの内部を通って、それを挿入し、それが自由に動くことを確認すること。チューブに針数mmをスライドさせることにより、ポリエチレン管の自由端に(ラット用)滅菌使い捨て25ゲージ針または(マウス用)ガラスマイクロ注射器の滅菌30ゲージの金属針を取り付けます。 (マウス用のラットについては、 図1Aおよび図1Bを参照してください)。
- 場所ガイドは、単一安楽死させた動物に、以下に説明挿管手順に従うことによって、動物への挿入の深さを示すように、金属カニューレとポリエチレン管の両方でマークします。観察のため胸腔を開き、適切に金属カニューレを配置し、(4.7節で説明したように)適切にポリエチレンチューブを進めます。消えないペンを使用すると、それは動物およびポリ口を満たす金属カニューレをマークそれは残りの動物に適切な配置を支援するために、金属カニューレの上部を満たすエチレンチューブ。
- 咽頭反射が(約1分)禁止されるまで、ドラフト(または適切な掃気システムを使用して)内で、1.5リットル/分の酸素中≤5%イソフルランで供給密閉チャンバーに一度に6匹まで麻酔。
注:前の任意の実験を行うには、不注意による致死的な暴露を防止するために、(室と動物のサイズ/種/株の例サイズ/タイプ)を使用している特定の条件の下でイソフルランのための安全な用量と曝露時間を確立します。 - 生理食塩水に無菌の先端を配置し、プランジャーに引き戻すことにより、滅菌生理食塩水(ラット用)滅菌使い捨て1 mLシリンジを埋めます。以下に説明するように(マウス用)滅菌ガラスマイクロ注射器を埋めます。ポリエチレンチューブに装着針にシリンジを取り付け、syringまで管を通して生理食塩水のボリューム全体をフラッシュしますeは空になります。
- (マウス用)マイクロ注射器を埋めるために、完全にシリンジから(ポリエチレンチューブに装着)金属プランジャーと針を取り外し、脇の両方を設定します。
- (上記のように)滅菌生理食塩水、滅菌使い捨て1 mLシリンジを記入し、滅菌使い捨て25ゲージ針を取り付けます。 (金属プランジャが挿入されます)マイクロ注射器の上部に針を挿入し、それは生理食塩水でマイクロ注射器をいっぱいになるまで使い捨て注射器のプランジャーを押し下げます。
- シャープコンテナにマイクロ注射器を埋めるために使用された使い捨て注射器と針を捨てます。マイクロ注射器の先端に(ポリエチレンチューブに装着)金属マイクロ注射針を再度取り付けて、生理食塩水の全体積は、注射器とチューブを通してフラッシュされるまで押し下げ、金属プランジャーを再挿入します。
- あちこち寒天ベースの接種物を注射器を埋めます水浴中の容器、およびフラッシュ寒天は、( 例えば 、完全に寒天を充填した)チューブがプライミングされるだけまで、管を通してメートル。
- ラットの場合、使い捨て注射器から(ポリエチレンチューブに装着)25ゲージ針を取り除きます。シャープコンテナで使用される注射器を廃棄します。接種物に滅菌チップを配置し、プランジャーに引き戻すことにより、水浴中でコンテナから寒天ベースの接種物を使用して新しい、滅菌使い捨て1 mLシリンジを埋めます。チューブは完全に寒天で満たされているだけまで、プランジャーを押し下げることによりチューブを通して(ポリエチレンチューブに装着)針とフラッシュ寒天を再接続します。
- マウスの場合は、マイクロ注射器から(ポリエチレンチューブに装着)金属マイクロ注射針や金属プランジャーを取り外し、脇に置きます。滅菌した使い捨ての1mLのシリンジおよび滅菌使い捨て25ゲージ針を使用して、コンテナから寒天ベースの接種材料を有するマイクロ注射器を充填4.4節で説明した充填手順を使用して、水浴。再アタッチ(ポリエチレンチューブに装着)金属マイクロ注射針を、チューブは完全に寒天で満たされているだけまで、チューブを介して金属プランジャー、およびフラッシュ寒天を挿入します。
- 麻酔室から一匹を削除してください。 図1Cに示すように、左に右に尾を頭で使い捨てのマットの上に仰臥位で動物を置きます。
- (ポリエチレン管を取り付けた金属カニューレすなわち )挿管器具を使用して、動物を挿管し、左肺の大きな葉にカニューレを挿入する( 図1Dを参照してください)。
- 動物の口の中に金属カニューレの自由端を挿入します。自由端が上向きに傾斜しているように、カニューレを回し、ゆっくりと慎重に若干のひねり運動と喉頭の構造をバイパスし、気管にそれを進めます。とは対照的に、気管に挿入を確認図1Cに示すように、左の人差し指で気管輪を触診しながら、静かに少し前後に数回カニューレをスライドさせることにより食道。
- カニューレが気管が左右の気管支に分かれる分岐部に到達すると、カニューレが左気管支に挿入されることを保証するために、動物の左側に向かってわずかにひねり運動をします。最後は途中で適切な深さに達したことを確認するために、以前に配置されたガイドマークを使用して、左肺下に四分の三、になるまで、金属カニューレを進めます。
- 代わりに金属カニューレでは、数mmのチューブポリエチレンを進めます。それだけで十分金属カニューレの端を終了し、肺に穴を開けていないまで前進されていることを確認するために、チューブに以前に配置されたガイドマークを使用してください。
- 代わりにカニューレの両方で、寒天suspeの(マウス用)(ラット用)100μLまたは20μLを植え付けるために取り付けられた注射器を使用します左肺の大きな葉に深いnsion( 図1Dを参照してください)。ポリエチレン管の数mmを撤回してから、静かに無傷の挿管デバイスを削除します。ガラスストレージ管に戻ってそれを設定し、回復するために、新鮮なケージに動物を移動します。
- 残りの動物を、麻酔挿管および接種を続行します。
- 麻酔した動物のバッチ間で、シリンジから(チューブに装着)針を取り除きます。ラットの場合は、シャープコンテナで使用される使い捨て注射器を廃棄し、水浴中で接種材料からの新しい、滅菌使い捨て注射器を埋めます。マウスについては、4.4節で説明したフィル技術を使用して、水浴中で接種材料から同じガラスマイクロ注射器を補充します。
- 寒天は、チューブを介して、挿管装置にフラッシュ残りのすべての寒天を厚くするために開始されます。 (ポリエチレンチューブに装着針を残して)注射器から針を外します。記載された手順に従ってくださいセクション4.4で完全にクリアする任意の閉塞に必要に応じて繰り返し、挿管装置を介して暖かい、滅菌生理食塩水をフラッシュします。空のすべてのシリンジから生理食塩水および4.5節で説明したように再び寒天接種材料を準備します。
- 生理食塩水懸濁液から決定CFUを使用して、動物あたり最終細菌接種(2.3節を参照)、生理食塩水懸濁液の最終希釈倍率寒天に( 例えば 10倍)を計算し、動物に注入量( 例えば、100μLのためにラットまたはマウスの場合は20μL)。
5.潜在的な誤接種やその他の有害事象のために動物を評価します
- 慎重に潜在的な誤接種のために評価するための麻酔からの寒天と回復の挿管、点眼時にすべての動物を観察します。すぐに、(ローカルIACUCガイドラインに従って)出血任意の動物を安楽死させる(例えば、呼吸困難やあえぎなど)異常な呼吸を呈する、移動しません通常のケージについて、または麻酔からの回復時に目-明るく健康的な表示されません。
- 呼吸の自発的な停止が発生した場合は(接種材料が十分に深く、ブロック気道に配置されていない場合、通常)、観察によって死を確認し、(そのような頸椎脱臼や開胸として)安楽死の第二の方法を実行します。
- 麻酔のみの手順を実行するのに数分のために必要とされるように、時間動物の長さは、イソフルランに曝露される最小限。注射用麻酔薬が使用される場合、動物は完全に目を覚ましまで監視下にあることを確認します。注射用麻酔薬を使用している場合、回復のために温めておいた環境で、動物、特にマウスを置きます。
- 顕著な呼吸、立毛、活性が低下し、低下し、体温:呼吸器疾患の以下の徴候のための試験期間中に少なくとも2回、毎日動物を観察します。すぐに(ローカルIACUCガイドラインに従って)瀕死である任意の動物、エクスペリエンス3を安楽死させますNCES呼吸困難または呼吸困難は、取り扱いの際に顕著に減少し、体温を持って、移動することができない、または不本意であるか、または食物と水に到達することはできません。
6. [管理テスト・トリートメント
- 計画された研究計画に係る試験治療を準備し、管理します。 1または2時間の感染後に治療の投与を開始する(またはより高いベースライン細菌負荷が所望される場合、さらなる処理を遅らせます)。それは研究の目的だけでなく、各個々の治療の性質に依存しているように、試験治療の調製および投与のための具体的な詳細を与えることはできません。 (例として図3を参照してください。)
- ベースラインコントロールとして機能するように感染し、未処理の動物の1グループに置いておきます。第7章で説明する手順を以下、他のグループのために開始された時の治療におけるこれらの動物の肺における細菌負荷を列挙します。
- PK / PD解析のために、評価血液および/または感染した動物の組織中の投与治療(単数または複数)の薬物動態プロファイル。薬物動態試験のための具体的な手順は、この記事の範囲外です。
7.肺からの生菌を列挙
- 治療は吸入暴露による研究期間(通常は24、48または96時間後の感染症)の終了時に、他のグループ(ベースライン)と残りのすべての動物のために開始された時点で未処理の動物の一つのグループを安楽死させると、徐々に炭素のレベルを上昇します密閉チャンバーまたはローカルIACUCガイドラインで推奨されているように、代替メソッド内で二酸化。観察によって死を確認し、(このような頸椎脱臼や開胸術など)安楽死の第二の方法を実行します。
- きれいな使い捨てのマットの上に仰臥位で動物を置き、徹底的にアルコールで胸の上に毛皮を濡らします。
- 無菌のはさみを使用して、筋層と胸郭の下にある、皮膚を通してカット胸腔を開くために胸骨に平行。優しく滅菌鉗子で肺を把握し、必要に応じて気管からそれらを分離するためにハサミを使用して、削除するために引き出します。余分な血液を吸収するために滅菌ガーゼの上に肺を置きます。心も削除されている場合は、それを離れて解剖し、捨てます。
- インテリアのセクションを公開し、ラボブレンダーバッグの底部に肺(プラス不注意オフ切り取られたすべての作品)を配置するために滅菌ピンセットを使用する滅菌ハサミで肺に小さな切れ端を行います。簡単に言えば、組織をつぶすためにバッグの外側の上に(例えば、ペンやマーカーなど)の厚さの丸いオブジェクトをロールバックします。ピペットで1袋に滅菌生理食塩水のミリリットル、ラボブレンダーにバッグを置き、2分間高速でラボブレンダーを実行します。
- ピペットを用いてチューブまたはプレートにブレンドされた袋からホモジナイズサンプルを転送します。 900μLのサリンに9-部品の生理食塩水に1部構成のホモジネートを等分することによってホモジネート10倍に希釈(例えば、100μLのホモジネートE)。 10倍同様に再びにより得られた懸濁液を希釈します。少なくとも6連続希釈物を、元のホモジネートから調製されるまで、別の10倍の要因によって、それぞれの新しい得られた懸濁液を希釈し続けます。
- ヒツジ血液( 肺炎球菌、肺炎桿菌、緑膿菌 またはA.バウマニ )やチョコレート寒天プレート上( インフルエンザ菌 )を補充したトリプチケースソイ寒天プレート上にすべての希釈から20μLそれぞれのピペット三重アリコート。またはCO 2なしで37℃で一晩インキュベートします。 (得られたプレートの例については、 図1Eを参照してください。)
- 「可算」の数( すなわち 、あまりにも多くはないコロニー合理的にカウントする)が含まれている最初の希釈で3つの複製のそれぞれにおけるコロニーを数えます。 3つの複製の平均値を計算します。合計1 mLを20μLのメッキを考慮するために(50によって平均値を乗算することにより、肺あたりのCFUを決定しますコロニーをカウントした時に元のホモジネートからの最終希釈率のホモジネート)とファクタリング。
Representative Results
ツールは、必要な動物の向き、及び挿管の深さは、図1に示されています。また、連続希釈し、肺ホモジネート試料の三重メッキした後、寒天プレート上で増殖するコロニーの代表的な例が示されています。ベースラインコントロールの上、いくつかのログ10 CFUの細菌負荷の増加は、典型的にはあっても96時間後の感染で、ほとんどの細菌単離するため、感染した肺で観察され、動物間変動性は低い( 図2)です。いくつかのインフルエンザの場合は、少し成長があるかもしれません。しかし、感染は48または96時間の期間( 図2B)内に自己解決に始めるべきではありません。二つの異なるシリーズ16、17の代表的な化合物については、 図3に示すように、この肺感染モデルは、SARをサポートするために、リードの化学シリーズの最適化中に使用することができます。それは一貫した、再現性のMETを提供します免疫動物におけるPK / PDを評価し、 肺炎連鎖球菌に対する阻害剤の新規なポリペプチドデホルミラー(PDF)の有効性と相関して最小発育阻止濃度(fAUC / MIC)を超える濃度-時間曲線下のその遊離薬物の領域を決定するために使用されたためにHODそして、 インフルエンザ ( 図4)。さらに、ベースラインコントロールからうっ血およびCFUで1-ログイン10削減のためfAUC / MICのターゲットは11 肺炎球菌と5 インフルエンザ菌分離株( 表1)18を横切って測定しました。ラットにおけるヒト薬物動態プロファイルを再作成するドラッグデリバリーシステムで、この感染モデルを結合することの前臨床研究にヒトの投与レジメンを評価するための強力なツールを作成します。この例は、アモキシシリン-クラブラン酸の持続放出製剤はeleva有する生物のための既存の用量レジメンよりも有効であったことを示しており、 表2に要約されていますテッドMICは、19値 。
図1: 非外科的気管内挿管。ツールは、ラット(A)及びマウス(B)を挿管するために示されています。技術を実行個人が右利きの場合は左に右に尾を頭で、Cに示すように麻酔後、動物を配置する必要があります。正しいカニューレ配置の確認のための気管輪を触診助けるために喉に優しく、左人差し指を置きます。ラット肺(D)の腹側図に示すように接種物は、深い左の肺内に配置する必要があります。試料の連続希釈およびプレーティングした後、寒天上で増殖するコロニーは、Eに示されたものと同様に表示されます。図1D、著作権©ギル・スミス[実験動物、25巻(1991)、G.スミス、Aラットにおける呼吸器感染症の確立のための気管支内点滴注入の簡単な非外科的方法、ページ46から49] 14。許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2: 感染した動物の肺における細菌増殖の代表的な例。 N = 5匹の動物/群からの標準偏差CFUデータは、 肺炎連鎖球菌 (A)、 インフルエンザ菌 (B)、 緑膿菌 (C)、 肺炎桿菌 (D)およびA.バウマンニの種々の分離株について示されている平均± (E)。各ペア(ライトグレー)の最初のバーは、ベースラインbacteです1または2時間後の感染でリアル負担、第二のバーは48時間後の感染(濃い灰色)または96時間後の感染(黒)でのエンド・オブ・研究増殖制御されています。データなし打ち切り法は適用されませんでした。従って、これらの結果は、群当たり全5匹の動物からのデータを含みます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3: リード最適化中に、種々の化学シリーズの有効性を評価します。記載された技術を使用して、肺感染モデルは、非細菌性タイプIIAトポイソメラーゼプログラムの一部として、構造 - 活性関係を調査するために利用されました。有望な化合物7と1がキノロン感受性(A)16またはキノロン耐性に対して評価しました。(B)、肺炎連鎖球菌の17の分離株、それぞれ。各シンボルは、CFUがグループを表す線は、平均と標準偏差で1ラットの肺から決定表します。定量化(LLQ)の下限は、1.7ログ10 CFU /肺でした。化合物は、滅菌水9 mLに溶解、(純粋な遊離親分子の56または112 mg)を秤量し、3 mLの水に3 mLの希釈(1:1)1日2回1ミリリットル/ 125グラムのラットの強制経口投与( 6から7時間離れて)2日間、1時間後の感染で始まります。未処理のコントロール(NTC)は、ベースラインの1時間後の感染でサンプリングまたは生理食塩水で処理し、成長を制御するための研究の終わり(48時間)でサンプリングしました。 。細菌IIA型トポイソメラーゼを標的に強力な抗菌剤として生物有機&薬用ケミストリー・レターズ、21巻、 ら TJマイルら、新規シクロヘキシルアミドから復刻図3A、ページ7483から7488まで、エルゼビアからの許可を得て著作権(2011)16、。図3Bは、TJマイルズら 、生物有機&薬用ケミストリー・レターズ、26巻から転載し、新規三環系( 例えば GSK945237)細菌タイプIIAトポイソメラーゼの強力な阻害剤として、ページ2464 - 。2469年、著作権(2016)17、エルゼビアの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4: 新規PDF阻害剤のPK / PD特性評価。 Emaxのモデルは、新規PDF阻害剤18のためのPK / PDのターゲットを特定するために、 肺炎球菌 (A)またはインフルエンザ菌 (B)の分離株と肺に感染した免疫応答性マウスにおける有効性データを範囲の用量使用して作成されました。サークル化合物の様々な用量で処置した4-5マウス/群からの平均細菌量を表します。分析は、フリーの薬物の24時間AUC(白丸)またはAUC / MIC(黒丸)との有効性を相関させるために行きました。許可を得て転載、微生物学、[抗菌剤と化学療法、60巻、2016年、頁180から189]のための著作権©アメリカの社会18。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
静止状態 | 10の減少を1ログ | ||||||
生体 | MIC 濃度(μg/ mL)を | R 2のために ラインFiのT(%) | fAUC | fAUC / MIC | fAUC | fAUC / MIC | 最大殺害 (10対数減少) |
肺炎球菌 | |||||||
10127 | 0.25 | 99.9 | 2.0 | 8.1 | 3.6 | 14.4 | 2.8 |
1316009S | 0.25 | 96.1 | 6.5 | 26.0 | 15.1 | 60.3 | 1.8 |
ATCC10813 | 0.5 | 100 | 8.4 | 16.9 | 22.2 | 44.5 | 1.2 |
1307007S | 1 | 95.816.1 | 16.1 | 20.1 | 20.1 | 2.7 | |
ATCC6303 | 1 | 99.8 | 19.8 | 19.8 | 24.8 | 24.8 | 2.8 |
1629 | 2 | 100 | 15.8 | 7.9 | 21.2 | 10.6 | 2.4 |
298443 | 2 | 99.9 | 26.5 | 13.2 | 31.0 | 15.5 | 2.3 |
336808 | 2 | 86 | 8.2 | 4.2 | 19.0 | 9.5 | 2.6 |
338860 | 2 | 99.5 | 2.9 | 1.5 | 6.7 | 3.4 | 2.8 |
  340449 | 2 | 94.6 | 8.0 | 4.0 | 14.9 | 7.4 | 2.1 |
L11259 | 2 | 100 | 7.1 | 3.5 | 9.0 | 4.5 | 2.0 |
平均±SD | NA A | NA | 11.0±7.5 | 11.0±7.9 | 17.0±8.2 | 19.5±17.8 | 2.3±0.5 |
中央値 | NA | NA | 8.2 | 8.1 | 19.0 | 14.4 | 2.4 |
インフルエンザ | |||||||
1998-100-126H | 1 | 99.7 | 7.3 | 7.3 | 13.4 | 13.4 | 2.9 |
503-008H | 1 | 99.8 | 7.1 | 7.1 | 13.9 | 13.9 | 2.7 |
08003H | 2 | 99.9 | 14.5 | 7.2 | 16.7 | 8.3 | 2.7 |
H128 | 2 | 96.6 | 15.3 | 7.6 | 26.0 | 13.0 | 2.7 |
19001H | 4 | 91.9 | 14.8 | 3.7 | 37.3 | 9.3 | 3.0 |
平均±SD | NA | NA | 11.8±4.2 | 6.6±1.6 | 21.5±10.2 | 11.6±2.6 | 2.8±0.1 |
中央値 | NA | NA | 14.5 | 7.2 | 16.7 | 13.0 | 2.7 |
NA、適用されません。 |
表1: 肺炎球菌 や インフルエンザ菌 分離株 に対する新規のPDF阻害剤のためのPK / PDターゲット 。フリー薬物AUCとうっ滞のAUC / MICのターゲットと1-ログ肺に感染し、化合物18で処理された免疫応答性マウスでは11 肺炎球菌と5 インフルエンザのために決定されたベースラインからのCFUで10の減少を。ダットA臨床開発のために選択したヒト用量を助けるために使用されました。この表は、適応し、許可を得て転載された、微生物学、[抗菌剤と化学療法、60巻、2016年、頁180から189]のための著作権©アメリカの社会18。
治療グループA | 株についてSD±10 肺炎連鎖球菌 (CFU /肺)、B(AMX / CAのMIC)を平均log: | |||||||
05010S (2μgの/ mL)を | 16001S C (4 / mlの) | 16001S (4 / mlの) | 30005S (4 / mlの) | 20009S (4 / mlの) | 05003S (8 / mlの) | 404053 (8 / mlの) | 47003S (8 / mlの) | |
コントロール | 7.3±0.4 | 7.0±0.8 | 5.7±1.2 | 7.1±0.7 | 7.1±0.4 | 6.4±0.6 | 6.8±0.4 | 6.0±0.3 |
AMX / CA | ||||||||
2000 / 125mgの入札(比16:1) | ≤1.7 ** | 2.8±1.2 ** | 2.2±0.8 ** | 2.3±0.9 ** | 2.5±0.9 ** | 2.0±0.9 ** | 3.8±1.4 ** | 1.8±0.2 ** |
1,000 / 125 mgのtidの(比8:1) | NT | NT | 2.8±0.5 ** | 2.7±1.3 ** | 3.3±0.9 ** | 4.9±0.5 ** | 6.6±1.3 | 4.7±0.7 ** |
NT | NT | 3.0±1.3 * | 2.1±0.7 ** | 3.2±0.4 ** | 5.2±0.9 * | 6.4±0.6 | 4.9±0.4 ** | |
125分の875 mgの入札(比7:1) | NT | NT | 4.5±1.2 * | 5.6±1.3 * | 5.2±0.7 ** | 6.3±0.7 | 6.4±0.7 | 5.5±0.4 |
125分の500 mgのTID(比4:1) | 3.1±1.3 ** | 4.5±0.9 ** | NT | NT | NT | NT | NT | NT |
アジスロマイシン、1,000 / 500 mgの外径 | NT | NT | NT | 5.8±2.0 | 7.1±0.9 | 3.1±1.0 ** | 6.6±0.4 | 6.07; 0.6 |
レボフロキサシン、500 mgの外径 | NT | NT | 4.2±0.8 * | 5.7±0.8 * | 4.9±0.8 ** | 3.0±1.3 ** | 3.5±0.2 ** | 3.9±0.8 ** |
治療グループD | 株についてSD±10 インフルエンザ (CFU /肺)を平均log: | |||||||
H128 (βラクタマーゼ陽性) | チェスターフィールド (βラクタマーゼ陰性の、アンピシリン耐性) | |||||||
コントロール | 6.4±0.6 | 6.7±0.6 | ||||||
AMX / CA | ||||||||
2000 / 125mgの入札(比16:1) | 2.0±0.7 ** | 3.1±0.9 ** | ||||||
1,000 / 125 mgのtidの(比8:1) | 2.1±1.0 ** | 3.6±1.1 ** | ||||||
125分の875 mgのTID(比7:1) | 2.8±1.3 ** | 3.8±1.3 ** | ||||||
125分の875 mgの入札(比7:1) | 2.0±0.8 ** | 5.1±1.1 ** | ||||||
アジスロマイシン、1,000 / 500 mgの外径 | 3.2±1.7 * | 5.8±1.1 | ||||||
レボフロキサシン、500 mgの外径 | ≤1.7 ** | ≤1.7 ** | ||||||
AMX / CA、アモキシシリン-クラブラン酸;入札、一日二回。 TID。、 一日に三回; OD、一日一回。 | ||||||||
B検出限界は<1.7でした。 *、コントロールと有意に異なる(0.05≤P); **、コントロールと有意に異なる(0.01≤P); NT、テストされていません。 | ||||||||
C株 16001Sは、2つの別個の実験で試験しました。 | ||||||||
dはアモキシシリン-クラブラン酸125分の500ミリグラム(4:1)一日三回はインフルエンザ株に対して試験しませんでした。 |
表2: 異なるアモキシシリン/クラブラン酸投与計画のための再作成ヒト血漿曝露プロファイルの有効性。このモデルを用いて、 肺炎球菌やインフルエンザ菌の分離株と肺に感染して免疫応答性ラットで生成されたデータは、アモキシシリン-クラブラン酸の強化された製剤を実証した(2一日二回、000/125 mg)を試験管の感受性19 に上昇したとの分離株に対する標準的な投与レジメンよりも有効でした。この表は、適応し、許可を得て転載された、微生物学、[抗菌剤と化学療法、ボリューム49、2005、ページ908から915]のための著作権©アメリカの社会19。
Discussion
この感染モデルを再生する際に最適な成功のために、次の追加の提案を検討する必要があります。先行研究に利用し、in vivoで 3回-新たな分離株の病原性は、2を継代することによって高めることができます。凍結した細菌株は常に元からできるだけ少ない通路を有する一次in vivoの由来源から調製し、そして再凍結や解凍した株式の再利用は推奨されるべきです。最近の臨床分離株を使用して肺炎を有する患者から回収し、及び/又は対数増殖期に培養物を調製することも、感染の確立を改善するのに役立つことができます。寒天中に5倍希釈( 例えば、2 mLの生理食塩水懸濁液を8 mLの寒天に添加)は、細菌接種材料を増やす代わりに10倍を用いることができ、接種量は、動物( 例えば、サイズに基づいて調整することができます200μL/動物は通常)250グラムのラットに接種します。生理食塩水細菌懸濁液を添加する前に寒天( すなわち、ステップ2.3において)、細菌密度を予測または目視検査、マクファーランド標準または光学密度測定によって推定することができます。それぞれがインビボ実験で行う前隔離するためのin vitro増殖特性に精通すると便利です。成長と取り扱いに一貫性は、任意の分離株のための細菌密度の最も正確な推定を可能にします。このような媒体および組織ホモジナイザー代替として、記載されたものと異なる標準微生物学的方法は、接種材料を調製し、感染した組織からの細菌を列挙するために適切に使用することができます。
非常に準備したり、実験の前日に寒天溶融し、50℃に設定し、別個の水浴中で一晩、それを保存することをお勧めします。これは、プロセスを簡素化し、寒天が、感染時の熱すぎるされるのを防ぐのに役立ちます。 41の温度 - 42°Cはmaintai間の良好なバランスを実現します寧短期細菌の生存のための熱すぎるされることなく液体状態の寒天。栄養寒天の可能な代替として、希寒天正常いくつかの実験で使用されています。寒天接種材料の一つのチューブは、全体の実験のために通常は十分です(と推奨されています)が、複数のチューブは、多数の動物を感染させるために調製することができる( 例えば 60以上)または感染プロセスが長く30以上かかる時- 45分の場合複数の接種材料チューブは、それが必要とされる寒天の各チューブに生理食塩水細菌懸濁液を追加し、必要とされます。これは、細菌の生存および/またはフィットネスは、接種前に高温に長時間曝露によって影響されるというリスクを低減します。複数の接種材料の管を使用して、追加の動物の無作為化手順を必要とし得ることに留意すべきです。可能な限り、同じ接種材料の準備からすべての動物に感染します。 TEで習熟の現在のレベルに実験のサイズを調整することをお勧めしますchnique。
( すなわち寒天接種物の完全な1シリンジで)バッチ当たり6匹の動物-熟練した科学者は挿管と接種動物を30秒未満にし、5まで接種することができます。技術を学ぶ人のために、速度は寒天が固化し始めるように重要です。しかし、接種物の正確な配置がより重要です。バッチ当たり1または2の動物で始まり、そして技術がより身近になるにつれて増加します。動物は挿管時に呼吸を続けます。 3分 - したがって、接種のための時間ウィンドウは、動物が約2であるべきイソフルラン、から回復どのように迅速に依存します。処理中に目覚めた動物は再度麻酔し、二度目を試みたが、それを繰り返しそうすることは推奨されていないことができます。習熟度が達成された後の最初の試みで成功接種は、動物のほぼ100%で期待されています。最初のラットを用いた技術を習得することが容易であることに注意してください。マウスは、あまりにも、より繊細で小さくなっていますすぐに操作されていない場合はlsが固化した寒天との遮断になりやすいです。前温暖化シリンジ、チューブや生理食塩水だけでなく、このような低設定に加熱パッドとして、暖かい(熱くない)表面に挿管器具を維持するとして、寒天の凝固を防ぐことができます。技術を学ぶとき、暗い色の染料(例えば、濃縮メチレンブルーなど)の代わりに寒天で細菌懸濁液を使用して接種物の適切な配置を実施することも有用です。説明された手順を実行しますが、(動物が麻酔と安楽死の間で回復することができない)染料の接種直後に動物を安楽死させます。色素が置かれている場所を特定し、それに応じて技術を調整するために解剖。
このモデルでの主要評価項目は、感染した肺からCFUです。サバイバルは、細菌負荷の良好な指標ではありませんし、推奨エンドポイントではありません。これはpredicteであるように、グループあたり6匹の動物 - 有効性研究のために、提案したNは5であります少なくとも90%の力で群間≥1対数10 CFUの差を検出するために、D。動物はケージの仲間が一緒のままで、または真のランダム化プロセスに従うことができるように、グループに感染させることができます。細菌の生存/フィットネスが高温にさらされた時間の長さによって影響を受けなかったことを確認する(グループはケージによって割り当てられている場合、グループは最後の感染エンド・オブ・研究成長コントロールとランダムシーケンスに感染しなければならないことに注意してください水浴中で)。メソッドを検閲なしのデータが必要ではないはず、と何も明らかに(前の任意の治療の開始に)研究の開始時に誤接種された任意の動物の即時撤去を除いて推奨されていません。試験前の最後に安楽死させた動物は、サンプリングされるべきであり、排除のための正当な理由は、( すなわち、感染または治療とは無関係のイベント)プロスペクティブに同定された場合を除き、結果はデータセットに含まれます。薬物キャリーオーバーかもしれAFF電気ショック療法いくつかのサンプルおよびすべてのin vivo感染モデル全体で重要な考慮事項です。化合物は、安楽死の際に頻繁に近い所定のまたは長い半減期を有している場合、それは、(細菌の列挙プロセスの間、細菌エクスビボを殺す希釈めっき続けるに十分に高い濃度で組織ホモジネート中に存在することができますサンプルまたは一晩のインキュベーション中に寒天プレート上)。これを防止するために、活性炭および/または細菌細胞を傷つけることなく活性分子を劣化させる添加剤は、従来の均質化サンプルに添加することができます。他の方法は、(上清中に残るべき)活性化合物の大部分を除去するために、サンプルを遠心分離し、十分に非阻害濃度に活性化合物を希釈するために、異なる希釈およびメッキ方式を採用するなどがあります。
私はこのモデルが成功し、 図2に示す例により証明されるように他のモデル( 例えば、インフルエンザ菌 )でよく成長しないものを含む広範囲の生物とげっ歯類の肺感染をnduces。これらの感染症は、実験が原因でモデルの故障および/または所定の分離株とのパフォーマンスの低下に繰り返される必要があります可能性を減少させる、一貫して再現性があります。動物が免疫応答性であるが、すべてであれば、彼らは、急速に感染を解決することはできません。多くの分離株は、好中球減少症を維持するために、反復注射を必要とせずに、少なくとも96時間を介して実行可能な感染症を維持するように、これは、研究の長さが増加し、柔軟性を可能にします。免疫適格動物における抗菌効力を研究する潜在的な利点は、以前に21を20指摘されている、といくつかの化合物( 例えばオキサゾリジノン)のために、非好中球減少げっ歯類からのデータをより正確に、これらのレンダリングされた好中球減少と比較して、ヒトの暴露目標を予測することができる、という証拠があります5。トンの多目的ユーティリティ彼モデルが比較のために、これらの研究は、リード最適化の努力16を支持するために、このモデルを用いて生成された公開され、未発表データの大規模なコレクションの一部、17、22-24であり、図3及び図4および表1および2に示されていますそして、提案した人間の投与は、19のレジメン25-29およびPK / PDの特徴付け18用の確認、30-32 .Whileこのモデルは、鼻腔内吸入方法に比べて実施するために、最初はより複雑である前述したように、多くの利点があります。練習と日常的な使用では、技術が実行するのは簡単になるはずです。
これは、ベースラインでの細菌量は、通常、他の肺感染モデルにおいて標的と比べて低かったいくつかの研究に注目することができます。これは、特にマウスでは、寒天に必要な希釈および小挑戦ボリュームに大部分が原因です。しかし、それにも留意すべきですその細菌の増殖は、最初の負荷が比較的低くても、全ての場合に見られました。ターゲットベースライン細菌負荷は、重症肺炎33でヒト患者において推定密度に相当する6 6.5ログ10 CFU /肺(平均肺重みに基づいて、マウスにおける組織の6.8〜7.3対数10 CFU / g)です。より高いベースラインの負荷はさらに細菌の接種材料を濃縮することにより、または追加の細菌の増殖を可能にするために、化合物投与の開始を遅らせることによって達成することができます。しかし、あまりにも多くの課題の負荷を増大させることに関係なく、感受性のすべての抗菌治療に不応性である異常に重度の急性疾患(24時間未満で、すなわち死)につながることができます。接種材料が最初に動物の左肺に優先的に配置されているが、感染は一般的に両方の肺全体に広がります。プログレッシブ肺疾患、他の臓器への細菌の普及、および最終的な罹患率は、多くの場合、observです肺炎球菌、肺炎桿菌および緑膿菌とエド。興味深いのは、 インフルエンザ 及びA.バウマニによる感染症は通常、より含まれていると稀に所定の細菌接種物で死に至るません。
このモデルから得られた有効性の結果は、in vitroの感受性プロファイルと同様に定義されたPK / PDターゲットとよく相関しています。細菌負荷の減少は日常的に、試験される薬剤の影響を受けやすいと考え分離株について観察されたものと考え耐性展示ベースライン16、17、19、24から29以上の変化がないか、細菌の増殖ながら。 2キノロンを評価ラットでの研究と、このモデル32を使用して、マクロライドは、ベースラインと比較して、肺炎球菌における1-log 10の還元に必要なPK / PDの目標はと、より重要なのは、好中球減少マウスで決定された目標と相関し、ことを示しています市中細菌PNEUMのための臨床目標onia 6、7、34、35。 Gepotidacin、新たなメカニズムの抗生物質は、複数の肺炎球菌に対して試験し、それは好中球減少大腿モデルにおける1-log 10の還元に必要なように、この肺感染モデル31で1-ログイン10削減のための同様のPK / PDターゲットを必要としました36肺浸透を考慮に入れた(ファイルのデータ)。同様に、 緑膿菌に対するGSK2251052のためのマウスで決定したPK / PDのターゲットはうっ滞のための一致した、1-およびこの肺モデル30と好中球減少大腿感染モデル間のCFUで10削減肺への浸透が37と考えられていた、38を 2ログ。鼻腔内接種を使用して、好中球減少、肺感染モデルとの相関が不良でした。しかし、GSK2251052は、その研究38の静的応答よりも多くを生成しませんでした。これは6ログと比較して8ログ10 CFU /マウスであった高い細菌接種、に起因する可能性が37および気管内挿管30モデルで10 CFU /マウス。それは翻訳予測能力を評価するために、既存のモデルや臨床データとの相関との直接比較を可能にするようにこのようなデータの収集は、ベンチマークのために重要です。気管内挿管、肺感染モデルのより広範な使用は、分析のこれらのタイプの付加的なデータを提供します。
この免疫応答性肺炎モデルのいくつかの制限があります。まず、高い細菌接種は、一般的にあまりにも重症感染症におけるこのような研究結果を得るために必要なので、自然発生的な耐性の出現を評価するには適していません。ベースライン時7または8ログ10 CFUの細菌の負担を達成するための試みの後、急速な罹患率は、既存の毒素(ファイル上のデータ)を削除するには接種材料の完全な洗浄にもかかわらず、(24時間未満で瀕死になって、すなわち動物)が観察されています。それ大きなげっ歯類を使用することによって、この問題を克服することが可能です。ラット、特に重いラット(> 250g)を、より良いマウスと比較した研究のこれらのタイプのために適切であり得るように、より高い接種材料を許容するように見えます。病原体相互作用:第2の制限は、感染増強剤として寒天の使用は、特定のホストの評価のためのモデルを使用して排除することができるということです。感染が完全に肺内に確立されるまで、寒天、保護焦点を提供すると考えられます。この問題を克服するためにではなく、寒天よりも生理食塩水に接種物を提供することが可能です。しかしながら、唯一のいくつかの単離物の感染を生成することに留意すべきです。第三に、技術に堪能になるために必要な急な学習曲線があります。手順は、特にマウスでは、微妙なことができます。誤って食道に金属カニューレを配置することが容易であり、過度の力が食道や気管のいずれかのパンクにつながることができます。接種材料の慎重な配置もあります必要または動物が十分に感染している可能性が回復するかどうかではないかのいずれかであり得ます。スムーズかつ正確に、しかし、忍耐と忍耐力で、1は非常に習熟することができ、迅速な技術を実行します。
、好中球減少の必要性を除去する堅牢性と再現性を増加させる、研究者がより多くの病原体及び単離物を研究することができ、実験設計の柔軟性を向上させ、肺炎のための薬力学を特徴づけるために挑戦的な感染を設けることにより、この免疫応答性肺感染モデルは、抗生物質の発見に相当な付加価値をコミュニティ。追加の研究者によって、このモデルの使用の増加は、より広く受け入れを獲得し、適切な解釈のための支援情報を提供することを継続するのに必要なベンチマークを提供するのに役立ちます。
Disclosures
著者は、すべての企業内グラクソ・スミスクライン医薬品および株式の自己株式の従業員を支払っています。
Acknowledgments
JHは、まず私たちにこのモデルを教えるために認め、メンター、友人や元マネージャーヴァレリー・ベリーに感謝したいです。私たちの基礎を教え、抗菌PK / PDの分野へのコミットメントに影響を与えたとゲイリーWoodnutt、。すべての著者は、私たちの科学のための彼のサポートと感謝のためのデビッド・ペインに感謝したいです。我々は、これらの方法、特にピートDeMarsh、ロブ・ストラウブ、ロニ・ページとNerissaサイモンを使用して生成されたデータのボディに貢献し、私たちの元in vivoでの微生物学の同僚を承認したいと思います。最後に、私たちのおかげで、特に私たちが要求するすべてのMIC(リン・マクロスキー、ジョシュウェストとシャロン分)を提供するために、彼らの援助のために私たちのin vitro微生物学の同僚に移動します。そして、専門家のアドバイスやサポートを提供し、当社の臨床微生物学チーム(リンダ・ミラー、ニコールScangarella - オマーン、デボラ・バトラー)のために。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
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