Dekstran forbedrer Lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av Murine og menneskelig primære NK celler
Summary
Målet med denne studien var å formulere teknologi som tillater for vellykket genet signaltransduksjon i primære naturlig killer () Celler NK. Den dekstran-mediert lentiviral signaltransduksjon menneske eller musen primære NK celler resulterer i høyere gene expression effektivitet. Denne metoden av genet signaltransduksjon vil vesentlig forbedre NK cellen genetisk manipulasjon.
Abstract
Den effektive Albin på bestemte gener i naturlige killer (NK) celler har vært en stor utfordring. Vellykket transductions er avgjørende for definering av rollen for genet av interesse i utvikling, differensiering og funksjon av NK celler. Nylige fremskritt gjelder chimeric antigen reseptorer (biler) i kreft immunterapi fremhever behovet for effektiv metode å levere eksogene gener til effektor lymfocyttene. Effektiviteten av lentiviral-mediert genet transductions i primære menneske eller musen NK celler forblir betydelig lav, som er en viktig faktor som begrenser. Nylige fremskritt bruker kationisk polymerer, som polybrene, viser en forbedret genet signaltransduksjon effektivitet i T-celler. Men kunne disse produktene forbedre signaltransduksjon effektiviteten av NK celler. Dette arbeidet viser at dekstran, en forgrenet Glukan polysakkarid, vesentlig forbedrer signaltransduksjon menneske musen primære NK celler. Denne svært reproduserbar signaltransduksjon metoden gir et kompetent verktøy for transducing menneskelige primære NK celler, som kan langt bedre kliniske gen levering programmer og dermed NK cellebasert kreft immunterapi.
Introduction
Naturlig killer (NK) celler er store lymfatisk befolkningen av medfødte immunsystemet1. NK celler fungerer som første linje forsvarerne av verten immunrespons mot svulster og infeksjoner2,3,4. NK celler også spille en sentral rolle i utviklingen av toleranse gjennom utskillelsen av potente cytokiner og chemokines5. Potent evne til å målrette og eliminere kreftceller, er flere kliniske forsøk gjennomført for å vurdere donor-avledet menneskelige NK celler som en adoptive immunterapi for kreft6,7. I motsetning til T-celler har utviklingsbiologi av NK celler ennå å være godt karakterisert8. Denne mangelen på kunnskap er delvis på grunn av fravær av effektive teknikker som leverer gener rundt til musen eller menneskelige primære NK celler. For disse grunner, har de fleste NK celler studier vært gjennomført i linjer, ikke i primære celler. Derfor er behovet for en pålitelig og effektiv protokoll som skal transduce primære NK celler med gener av interesse avgjørende.
Det overordnede målet med denne studien var å formulere en konsistent og pålitelig metode som primære menneskelige eller murine NK celler kan være transduced med lenti- eller retroviruses.
Tidligere studier som forsøkte å løse dette problemet har blitt utført, hovedsakelig bruker forbigående transformasjonen av primære NK celler. Dette inkluderer plasmider transfection9,10, Epstein – Barr Virus (EBV) / retroviral hybrid vektor11, vaccinia vektorer12,13, og Ad5/F35 chimeric adenoviral vektorer14. Til tross for beskjeden effektiviteten av disse teknikkene gjør forbigående natur signaltransduksjon dem uegnet for langsiktig bruk av genmodifiserte NK cellene. Noen studier har brukt retroviral vektorer for å transduce NK celler, som krever flere sykluser av infeksjon å oppnå et akseptabelt nivå gene expression11,15. I motsetning til retroviral vektorer, kan lentiviral vektorer bruke verten celle kjernefysiske import maskiner for å translocate viral før integrering komplekset i kjernen. Dette er en viktig begrensende faktor i replikering av viruset i ikke-dele celler, som inkluderer primære NK celler.
Interaksjoner mellom ulike celle-overflate reseptorer og virus partikler tillater viral opptak inn i cellen. De første engasjementer mellom viral konvolutt proteiner og deres beslektet vert reseptorer kan være begrenset på grunn av potensielle negative kostnadene eksisterende mellom disse to. Begrunnelsen bak mange signaltransduksjon teknikker er at tillegg av kationisk polymerer, som polybrene (Pb), protamine sulfate (PS) eller dekstran, kan gi en positiv ladning til celle-overflate reseptorer og dermed øke binding av viral konvolutten proteiner. Dette vil øke fusion effektiviteten og opptaket av viral partikler av celler16. Selv om det har blitt rapportert at Pb eller PS kan forbedre genoverføring i T celler17, har programmet ikke noen effekt i signaltransduksjon effektiviteten av primære NK celler. Videre er en komparativ analyse mellom disse reagensene bruke primære NK celler ikke utført. I denne studien ble signaltransduksjon effektiviteten av de tre kationisk polymerer sammenlignet. Resultatene viser at blant disse tre kationisk polymerer, bare dekstran signifikant øker effektiv viral signaltransduksjon inn både mus og menneskelige primære NK celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien viser at bruk av dekstran som en kationisk polymer agent forbedrer lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av både murine og menneskelige primære NK celler. I tillegg har andre kationisk agenter, som Pb eller PS, ingen merkbar innvirkning på levering av viral vektorer i menneskets primære NK celler. Tidligere har det vært vist at Pb kan utvide genet signaltransduksjon i menneskelige T celler17. Disse resultatene, men foreslår at Pb verken PS har en lignende effektivitet p?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Lucia Sammarco og hennes Lulu Lemonade Stand for inspirasjon, motivasjon og støtte. Dette arbeidet var støttes delvis av NIH R01 AI102893 og NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (SR); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Alex Lemonade Stand grunnlaget (Romagna); HRHM programmet i MACC Fund (Romagna; LØPING; M.S.T); Nicholas Family Foundation (Romagna); Gardetto familien (Romagna); Hyundai forskere programmet (M.S.T.); Hyundai håp på hjul (SR); MACC fondet (M.S.T. og Santa Maria) Children’s Research Institute, MCW (SR); og Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).
Materials
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
Riferimenti
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
- Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
- Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
- Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
- Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
- Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
- Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
- Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
- Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
- Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
- Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
- Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
- Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
- Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
- Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
- Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
- Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
- Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
- Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
- Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).
