تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي
Summary
We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
Abstract
في معظم الثدييات، عظيمات السمع في الأذن الوسطى، بما في ذلك المطرقة، السندان والركابي، هي أصغر العظام. في الفئران، وهو هيكل عظمي يسمى الفقاعة السمعية منازل للعظيمات، في حين أن كبسولة السمعية يرفق الأذن الداخلية، وهي القوقعة والقنوات الهلالية. العظيمات الفئران ضرورية لسماع وبالتالي من مصلحة كبيرة للباحثين في مجال طب الأذن والحنجرة، ولكن من عملية التمثيل الغذائي، والتنمية، وتطور وذات أهمية كبيرة لغيرها من المجالات. تغيير استقلاب العظام يمكن أن تؤثر على وظيفة السمع في فئران بالغة، ومختلف الفئران الجينات نقص تظهر التغيرات في التشكل من عظيمات السمع في الرحم. على الرغم من عظيمات السمع الفئران هي صغيرة، والتلاعب بهم ممكنا إذا كان أحد يفهم ميولهم التشريحية وهيكل 3D. هنا، نحن تصف كيفية تشريح الفقاعة السمعية وكبسولة من الفئران بعد الولادة ثم عزل عظيمات الفردية عن طريق إزالة جزء من الفقاعة. نحن أيضا مناقشة كيفية مالسرير الفقاعة وكبسولة في اتجاهات مختلفة لتوليد البارافين أو أقسام المجمدة مناسبة لإعداد المقاطع الطولية الأفقية أو الجبهي من المطرقة. وأخيرا، فإننا تعداد الاختلافات التشريحية بين الفأر والإنسان عظيمات السمع. أن هذه الأساليب يكون مفيدا في تحليل الجوانب المرضية والتنموية والتطورية للعظيمات السمع والأذن الوسطى في الفئران.
Introduction
وعظيمات السمع الثلاث في الأذن الوسطى، وهي المطرقة، السندان، والركابي، تشكل سلسلة السمعية الثدييات محددة التي تنقل الصوت من الغشاء الطبلي إلى الأذن الداخلية، أو القوقعة 1،2. السمع وظيفة يمكن تقييمها في الفئران عن طريق قياس سمعي جذع الاستجابة (ABR) عتبات 3-6، واهتزاز المطرقة وراء يمكن رصدها باستخدام الليزر دوبلر Vibrometry (LDV) 7 الغشاء الطبلي. من خلال الجمع بين ABR، LDV، والقياسات تشويه المنتج Otoacoustic الانبعاثات (DPOAE)، وفقدان السمع التوصيلي يمكن أن يكون هناك تمييز من ضعف الحسي 8.
هناك حاجة إلى نماذج حيوانية من الظروف الأذن، نظرا لأهمية السمع وصحة الأذن إلى رفاه المرضى من جميع الأعمار. على سبيل المثال التهاب الأذن الوسطى هو التهاب الأذن شائعة جدا ينظر في الرضع والأطفال الإنسان، والحادة، التهاب الأذن الوسطى الحاد ويمكن أن يحدث مضاعفاته إذا كان كونديلم يتم علاجه نشوئها مع مضادات الجراثيم المناسبة 9. قد تكون نماذج الماوس من التهاب الأذن الوسطى مفيدا في فهم المرضية وفي تطوير علاجات 10،11.
العظيمات الفئران، التي تتشكل (باستثناء الجزء goniale من المطرقة) التي تعظم غضروفي 12،13، هي ذات أهمية كبيرة لدراسة استقلاب العظام والتشكل. أولا، صغر حجمها يسمح تحليل عالية الدقة للعظام مع السمحاق سليمة باستخدام الأشعة السينية أو المجهري مضان 14. ثانيا، الشاذة استقلاب العظام، مثل المفرط أو نقص ارتشاف العظام، أو تفاعلات ضعاف بين الخلايا العظمية 15، يمكن تحليلها كمساهم محتمل لفقدان السمع 3،4،7. وذكر الثالث، غير طبيعي التشكل عظيمات في الفئران عدة جينات ناقصة، مثل الحيوانات التي تفتقر إلى Hoxa2 16-19، 20-22 الجينة Msx1، Prrx1 23، Goosecoid(GSC) 24،25، Bapx1 13، Tshz1 26، Dusp6 (Mkp3) 27، رأس (وتد) 28، Fgfr1 29، وهرمون الغدة الدرقية مستقبلات (Thra، Thrb) 5، Bcl2 30 وغيرها 1،31، أو في الفئران overexpressing Hoxa2 32. وأخيرا، على الرغم من صغر حجمها، والهياكل المرتبطة عظيمات مثل العضلات والمفاصل 33 34،35 يمكن الوصول إليها.
العظيمات الماوس هي أصغر من عظيمات الإنسان، ولكن من الجدير بالذكر أن الأذن الوسطى الماوس ليست نسخة مصغرة من نظيرتها الإنسان. على سبيل المثال، في الفئران، الشريان الركابي، الذي يمر من خلال حلقة من الركابي، استمر طوال حياته 36، في حين أنه في البشر، يختفي الشريان الركابي الجنينية أثناء الحمل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مورفولوجية المطرقة الماوس يختلف من عشرالبريد العظم البشري (أنظر الشكل 6). في الفئران، الفقاعة السمعية (طبلي) يرفق تجويف الأذن الوسطى مليئة بالهواء، في حين أنه في البشر، وخلايا الخشاء الهواء يتكون من العظام التربيقي في العظم الصدغي ويوجد في عظيمات بدلا من الفقاعة 37. في كلا النوعين، وكبسولة السمعية (الكبسولة، التي التيه العظمي) يرفق القوقعة والقنوات الهلالية في الأذن الداخلية. وقد استعرضت علم الأحياء التطوري المقارن والأذن الوسطى على نطاق واسع 38-40.
بروتوكول الواردة أدناه أولا يصف كيفية تشريح خارج الفقاعة السمعية وكبسولة، والتي تتكون أساسا من الأذن الوسطى والأذن الداخلية، على التوالي. يوضح هذا البروتوكول أيضا كيفية عزل المطرقة، السندان والركابي من الفقاعة السمعية. وأخيرا، فإنه يظهر كيفية توجيه الفقاعة السمعية وكبسولة لتضمين استعدادا لباجتزاء الأنسجة من عظيمات السمع.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، فإننا نقدم وسيلة مفيدة لعزل الفقاعة السمعية وكبسولة في الفئران بعد الولادة. قبل P12، أنسجة هشة ويمكن أن تصبح التالفة أثناء العزلة. بعد P12، الفقاعة السمعية وكبسولة يمكن عزلها عن الأنسجة المحيطة بها. تشريح الفقاعة من الرأس قبل باجتزاء ديها العديد من المزايا. أولا، التجويف ما بعد الولادة ونمو الفقاعة السمعية تحدث معظم بنشاط من P6 فصاعدا وهي كاملة من قبل P14 50. يتم استبدال الأنسجة الوسيطة بين الغشاء الطبلي وجدار القوقعة عن طريق الجو من خلال عملية التجويف. الهواء الناجم عن ذلك في تجويف الأذن الوسطى يمكن أن تعوق الاتصال بين الأنسجة والسوائل أثناء التثبيت، وزوال الكلس والتضمين. فمن الأسهل لإزالة الهواء من الفقاعة السمعية معزولة بقطع النهاية (عملية إبري الشكل) الأمامية بدلا من محاولة القيام بذلك في الفقاعة unisolated. ثانيا، توجه المطرقة (والغشاء الطبلي) ليس الرأسيفي الرأس. ولذلك فمن الأسهل إلى قسم المطرقة في الطائرات المطلوب عن طريق دمج الفقاعة السمعية معزولة وكبسولة في اتجاه معين.
مرة واحدة معزولة، الفقاعة السمعية وكبسولات مفيدة للعديد من التحليلات. على سبيل المثال، يمكن أن ارتفاع قرار الأشعة السينية الصغرى CT كشف العظام المجهرية التشكل مثل الشعيرات الدموية المكونة للعظم في المطرقة 14. وstereofluorescence تشريح المجهر هو أداة قوية لتصور الهياكل في تقييم الفئران مراسل معربا عن البروتينات الفلورية في الوسط أو الداخلية الأذن 33. بالإضافة إلى ذلك، مختلف في الجسم الحي أو خارج الجسم الحي مضان طرق وضع العلامات وكله جبل كشف المناعي يمكن الاضطلاع بها. ضوء ورقة مضان المجهر مفيد أيضا لتحليل ثلاثي الأبعاد-51. وإن لم يكن هو موضح هنا، والهياكل التشريحية المختلفة المرتبطة الفقاعة السمعية وكبسولة مثل الأعصاب الطرفية، والأوعية الدموية، والغشاء الطبلي في الأذن الوسطى كما يمكن تقييمها باستخدام هذا البروتوكول.
لاحظ أن باجتزاء البارافين يتطلب زوال الكلس للأنسجة العظام قبل التضمين، وبالتالي لا يسمح تحليل تمعدن. على النقيض من ذلك، فإن طريقة فيلم كاواموتو 43 المستخدمة في إعداد أقسام المجمدة يمكن أن يؤديها من دون زوال الكلس ومناسبة للدراسات تمعدن استخدام في تقنيات العظام وضع العلامات الجسم الحي أو تلطيخ خاص مثل الصبغ الأحمر تلطيخ. ينبغي أن يكون الأمثل ظروف البرد باجتزاء .. وفقا القائم على أساس السن الماوس. على سبيل المثال، ينصح درجة حرارة أقل باردة داخل الغرفة ناظم البرد لعينات الماوس القديمة للحد من الأضرار التي لحقت أقسام.
وفي الماوس، المصطلح الصحيح للنتوء بارز شبه كروية من المطرقة هو "نتوء الدويري". ومع ذلك، فإن مصطلح "خنصر الناتئ" وقد استخدم على نطاق واسع للإشارة إلى نتوء الدويري لمزيد من اللعقدين من الزمن، وخاصة بين الماوس علماء البيولوجيا التطورية 16،20،22-25. "الناتئ القصير" يشير أصلا إلى عملية الجانبية (الناتئ الوحشية)، والذي يختلف من نتوء الدويري. في البشر، وهي عملية تشبه الجانبية إسقاط مخروطي طفيف تشكل الخط العام للمرفق إلى غشاء الطبل، وتمتد من قبضة القص (لم أر في الشكل 6B، عرض وسطي). في الفئران، وعملية الجانبية هي أيضا إسقاط المقبض في الطرف المقابل لبجرة 48. في الجزء الرخو من الغشاء الطبلي فوق عملية الجانبية للالمطرقة. نتوء دائري ليست واضحة في المطرقة الإنسان.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
| Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
| 14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
| Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
| Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
| Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
| Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
| Marking Pin | Various | ||
| Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
| Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
| TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
| Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
| Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
| Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
| Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
| Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
| Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
| Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
| NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
| KCl | wako | 285-14 | for PBS |
| Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
| KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
| Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
| EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
| Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
| Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
| Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
| Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
| Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
| Eosin | wako | 051-06515 |
Riferimenti
- Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
- Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
- Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
- Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
- Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
- Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
- Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
- Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. , (2009).
- Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease?. N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
- Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
- Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879 (2014).
- Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
- Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
- Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
- Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
- Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
- Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
- O’Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
- Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
- Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
- Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
- Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
- Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
- Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
- Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
- Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
- Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
- Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362 (2012).
- Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
- Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
- Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
- Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
- Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134 (2007).
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
- Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. 22, 419-432 (2012).
- Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
- Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
- Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
- Henson, O. W., Keidel, W. D., Neff, W. D. Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), 39-110 (1974).
- . . Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , (2003).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kampen, P. N. V. . Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, 321-722 (1905).
- Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
- Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
- Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
- Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
- Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
- Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).
