Summary

L'utilisation d'un TMEM184A GFP-tagged Construct pour Confirmation de Heparin Receptor Identity

Published: February 17, 2017
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Summary

Un TMEM184A codant pour la construction d'une étiquette de la GFP à l'extrémité carboxy-terminale conçu pour l'expression eucaryote, a été utilisé dans des essais visant à confirmer l'identification de TMEM184A comme récepteur d'héparine dans les cellules vasculaires.

Abstract

Lorsque de nouvelles protéines sont identifiées par l'isolement et l'analyse bioinformatique basée sur l'affinité, ils sont souvent en grande partie non caractérisés. Des anticorps dirigés contre des peptides spécifiques de la séquence prédite permettent des expériences de localisation. Cependant, d'autres interactions possibles avec les anticorps ne peuvent souvent pas être exclus. Cette situation a permis d'élaborer une série de tests qui dépendent de la séquence protéique. Plus précisément, une construction contenant la séquence de gène couplé à la séquence codant pour la GFP à l'extrémité C-terminale de la protéine a été obtenu et utilisé à ces fins. Des expériences pour caractériser la localisation, l' affinité du ligand, et le gain de la fonction ont été initialement conçues et réalisées pour confirmer l'identification des TMEM184A comme un récepteur d'héparine 1. En outre, la construction peut être utilisé pour des études portant sur la membrane des questions de topologie et des interactions protéine-ligand détaillés. Le présent rapport présente arange de protocoles expérimentaux basés sur la construction GFP-TMEM184A exprimé dans les cellules vasculaires qui pourraient facilement être adapté à d'autres nouvelles protéines.

Introduction

L'identification des protéines candidates pour de nouvelles fonctions dépend souvent des protocoles d'isolement basées sur l'affinité suivie par une détermination de séquence partielle. De récents exemples de protéines nouvellement identifiées comprennent la protéine transmembranaire 184A (TMEM184A), un récepteur d'héparine identifié après les interactions d'affinité d' héparine 1 et TgPH1, une protéine de domaine pleckstrine qui se lie phosphoinositide PI (3,5) P2 2. Autre nouvelle identification des protéines implique une analyse de séquence directe de peptides tel que , par Vit, et al. qui a utilisé des peptides transmembranaires pour identifier les produits de protéines à partir de gènes précédemment non caractérisés 3. De même, l' identification de nouvelles séquences de protéines peut être réalisée en utilisant la bioinformatique à la recherche de familles de protéines précédemment caractérisées telles que l' identification de nouvelles protéines 4TM 4. L'examen des séquences de gènes de la famille des aquaporines a alainsi cédé l'identification de nouveaux membres avec de nouvelles fonctions 5. Après l'identification, l'analyse de la fonction des protéines est typiquement une étape suivante qui peut parfois être examinée à l'aide d'un dosage spécifique de la fonction de la protéine comme dans le cas d'aquaporine.

Lorsque cela est possible, la fonction d'une protéine nouvellement identifiée peut être examinée avec enzymatique spécifique ou des tests de fonction similaires in vitro. Étant donné que de nombreuses fonctions nouvelles protéines dépendent des interactions complexes qui se produisent uniquement dans des cellules ou organismes intacts, dans des essais in vitro ne sont pas toujours efficaces. Cependant, les dosages in vivo doivent être conçus de telle sorte qu'ils dépendent de la séquence du gène. Dans la culture cellulaire, et / ou des organismes modèles simples, knockdown peut apporter la preuve pour l'identification de protéines / fonction 6. Avec de nouvelles protéines identifiées comme indiqué ci-dessus, il est souvent insuffisant pour simplement renverser une protéine pour confirmer la fonction, und la conception des tests fonctionnels in vivo qui dépendent de la séquence du gène devient important pour la caractérisation de nouvelles protéines.

L'identification récente de TMEM184A comme un récepteur d'héparine (qui module la prolifération dans le muscle lisse vasculaire et des réponses inflammatoires dans les cellules endothéliales) utilisant la chromatographie d'affinité et MALDI MS 1, 7 a été l'occasion de développer une collection d'essais après knockdown a abouti à des résultats cohérents avec l'identification . Une étude récente a confirmé que l' héparine interagit spécifiquement avec plusieurs facteurs de croissance, leurs récepteurs, les composants de la matrice extracellulaire, des récepteurs d'adhésion cellulaire et d' autres protéines 8. Dans le système vasculaire, l' héparine et l' héparane sulfate protéoglycanes (contenant du sulfate d' héparane des chaînes de structure similaire à l' héparine) interagissent avec plusieurs centaines de protéines 9. Pour confirmer fonctionnellement that TMEM184A a été impliqué dans l'absorption d'héparine et de liaison, les techniques qui employaient la construction de gène pour TMEM184A ont été développés. Le présent rapport comprend une collection de tests basés sur une GFP-TMEM184A construire pour une utilisation à confirmer l'identité du TMEM184A comme un récepteur de l'héparine.

Protocol

1. Conception d'une construction GFP-protéine Achat, ou de la conception et de la construction, une construction de GFP-tagged basé sur la protéine en question. NOTE: Pour une construction acheté, des vecteurs standards sont disponibles auprès des laboratoires commerciaux qui incluent certaines ou toutes les suggestions suivantes: Pour une protéine membranaire, sélectionner un emplacement de C-terminale de la GFP, car il est moins susceptible d'interférer avec le trafic de protéine mem…

Representative Results

Bien qu'en théorie, la transfection d'une construction d' ADN dans des cellules peut être réalisée avec des réactifs de transfection lipophiles, les rapports précédents indiquent une transfection plus efficace de la GFP dans les cellules endothéliales construit en utilisant une électroporation 12. Le protocole fourni ici typiquement obtenu GFP dans la construction d'expression supérieure à 80% des cellules endothéliales primaires et dé…

Discussion

Les protocoles présentés ici ont été conçus pour fournir une preuve de confirmation pour l'identification de TMEM184A en tant que récepteur de l' héparine dans des cellules vasculaires 1. techniques Knockdown sont couramment utilisés comme un mécanisme permettant de confirmer l'identification de nouvelles protéines. Cependant, une certaine perte fonctionnelle après l'effet de choc est en général pas suffisamment de preuves qu'une protéine candidate est en fait le…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.

Materials

GFP-TMEM184A construct OriGene RG213192
Rhodamine-Heparin Creative PEGWorks HP-204 Light Sensitive
Fluorescein-Heparin Creative PEGWorks HP-201 Light Sensitive
Mowiol EMD Millipore 475904-100GM
Paraformaldehyde (methanol free) Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific PI28908 at Fisher Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific PI15510 at Fisher Pay attention to shelf-life
Black 96 well plates Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific 064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line ATCC CRL 1444 Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. B304-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells Cell Applications, Inc. B354-05 Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells Cell Applications, Inc. R304-05a Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads Sigma S1638
HeBS Available from Bio-Rad Can be prepared in the lab.  The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus Santa Cruz Biotechnology sc292006 Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus Obtained from ProSci Inc, Poway, CA  Pro Sci 5681 ProSci used in figure 1
GFP antibodies Santa Cruz Biotechnology sc9996 Used in figures 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC)
715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining.
CHAPS Purchased from Sigma C5849 Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35 mm dishes MatTek (Ashland MA) P35G-1.0 – 20 mm – C
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope Nikon C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens Used for images in Figure 5
Confocal Microscope Zeiss Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment Bio-Rad Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes Available from MidSci EC2L Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader TECAN TECAN Infinite® m200 Pro plate reader Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Program and information available on-line
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail  
Cell Culture trypsin solution Sigma T4174 purchased as a 10X solution

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Farwell, S. L. N., Slee, J. B., Li, Y., Lowe-Krentz, L. J. Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity. J. Vis. Exp. (120), e55053, doi:10.3791/55053 (2017).

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