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Biologia

Un rapide, méthode évolutive pour l'isolement, l'étude fonctionnelle, et l'analyse de la matrice extracellulaire de cellules dérivées

Published: January 04, 2017
doi:
10.3791/55051
, ,
1School of Biochemistry,University of Bristol

Summary

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.

Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Introduction

Au cours des dernières décennies, la matrice extracellulaire (ECM) est reconnu comme un environnement diversifié, dynamique et complexe qui est impliqué dans plusieurs processus cellulaires physiologiques et pathologiques. Au niveau du tissu, l'ECM influe sur la signalisation cellulaire, la motilité, la différenciation, l' angiogenèse, la biologie des cellules souches, la tumorigenèse, la fibrose, etc. 1,2. L'étude de l'organisation et les processus ECM ECM-dépendante a donc des implications larges pour la biologie cellulaire et de la physiologie des tissus. Pour parvenir à une compréhension mécaniste de la composition ECM, l'organisation, et les propriétés fonctionnelles, les méthodes pour l'isolement précise des ECM sont nécessaires. Alors que la première identification des protéines ECM invoquées isolement à partir de tissus 3, la préparation d'ECM à partir de cellules cultivées est devenu plus répandu.

L'isolement et l'analyse des ECM dérivé des cellules est compliquée pour deux raisons principales. Tout d'abord, la présence de cellules etprotéines intracellulaires abondantes ir peuvent rendre difficile d'isoler l'ECM comme une structure extracellulaire discrète. En effet, certaines protéines de la MEC ont un rôle à l' intérieur de la cellule ainsi que dans l'ECM 4; Par conséquent, l'élimination efficace des protéines intracellulaires de l'ECM dérivé des cellules est indispensable si l'étude des protéines au sein de l'ECM est à ne pas confondre avec leurs rôles à l'intérieur de la cellule. D'autre part, l'ECM provenant d'une cellule se compose d'un grand nombre de grandes protéines oligomériques, qui sont souvent de manière covalente réticulée lors de l'assemblage ECM et sont par conséquent insolubles dans les détergents classiques. Ces propriétés peuvent compliquer l'extraction et l'analyse plus approfondie des ECM. Pour remédier à ces problèmes, une méthode est requise qui permet la séparation efficace des protéines ECM à partir de composants cellulaires.

Plusieurs procédés ont été décrits dans la littérature pour l'isolement de l'ECM soit de culture cellulaire ou des extraits de tissus. Beaucoup de ces méthodes sont destinées à l'extraction de l'ECM abondant protein, le collagène, des tissus et comprennent l'utilisation de sels neutres 3, des conditions acides 5,6 ou 7 pepsine. L'isolement de l'ECM au total à partir des extraits de tissus implique souvent décellularisation du tissu avant l'isolement de l'ECM. Par exemple, un procédé d'extraction séquentielle a été décrit que les isolats de l' ECM à partir de tissu cardiaque humain 8. Tout d'abord, les protéines d'ECM faiblement liées ont été extraits avec 0,5 M de NaCl avant le dodécylsulfate de sodium (SDS) a été utilisé pour éliminer les cellules. Enfin, les protéines ECM restantes ont été extraites à l' aide de guanidine 4 M 8. ECM peut également être solubilisé à partir d' échantillons décellularisés utilisant l' urée 8 M 9. D' autres techniques utilisent des détergents, tels que l' acide désoxycholique 10, pour extraire les cellules et ECM avant la séparation des protéines insolubles de l' ECM à partir du lysat cellulaire soluble par centrifugation.

La méthode pour l'isolement et l'analyse des ECM provenant d'une cellule décrite dans le présent rapport fournit une reproProcédé ductible pour éliminer le matériau cellulaire, en laissant ECM dérivé de cellules qui peuvent être analysées par immunofluorescence in situ ou extraite pour des analyses biochimiques. Cette méthode peut être adaptée à tout type de cellules adhérentes et peut être adapté pour des procédures en aval, comme immunotransfert ou spectrométrie de masse, ou pour l'utilisation de l'ECM isolé dans des études fonctionnelles. Le procédé peut également être utilisé en association avec la microscopie confocale de cellules vivantes pour suivre le dépôt d'ECM d'une protéine étiquetée d'intérêt en temps réel. Ceci est obtenu par l'utilisation d'un plat à fond de verre maillées. Dans l'ensemble, l'approche fournit un isolement précis de l'ECM dérivée des cellules et également le champ pour identifier et surveiller le dépôt et la dynamique des protéines ECM individuelles.

Protocol

1. Suppression des cellules avec Ammonium Hydroxide Solution Préparer cellules adhérentes par placage à la densité appropriée. REMARQUE: Les cellules peuvent être tout type de cellules adhérentes qui produit ECM suffisante pour l'analyse. Ici, nous décrivons l'utilisation de cellules COS-7, une ligne de singe vert africain de rein de fibroblaste cellule qui contient des séquences d'ADN viral SV-40; RCS, une lignée cellulaire de chondrosarcome de rat; ou fibroblaste dermique humain normal (HDF) des souches de prépuce juvénile. HDF sont utilisés de passage 1 à passage 8 seulement. Plaque les cellules sur des lamelles pour l'imagerie des cellules vivantes et ECM, pour des études de microscopie par fluorescence d'ECM fixe, ou pour la préparation d'ECM dérivé de cellules pour des tests fonctionnels à petite échelle. Plaque les cellules sur des boîtes de culture cellulaire pour l'analyse SDS-PAGE, immunotransfert, ou des études de protéomique. REMARQUE: Les conditions de culture cellulaire (nombre de cellules à plaque et un milieu de culture) dépendra du type de cellule. Le nombre de cellules à la plaque devraêtre établie de manière empirique pour la lignée cellulaire particulière ou d'une souche de cellule. Laisser un temps approprié pour les cellules pour déposer ECM, typiquement> 16 h. NOTE: La période de temps dépendra du type de cellule et devra être déterminée de manière empirique. Si la conduite expression ectopique, laisser le temps approprié pour l'expression de la protéine transfectées d'intérêt et pour le dépôt de l'ECM. Dans un capot extracteur, Préparer 20 mM d'hydroxyde d' ammonium dans un récipient approprié par dilution de la solution 1/14 avec H De ionisé 2 O. Retirer les cellules de l'incubateur et retirez délicatement le milieu de culture. Ajouter un tampon phosphate salin (PBS) sans Ca2 + / Mg2 + en versant doucement contre les parois de la boîte. Rock the dish deux fois et enlever le liquide avec une pipette de transfert en plastique. Répéter deux fois plus. Dans une hotte aspirante, inclinez chaque plat et enlever le PBS de l'étape 1.2 avec une pipette de transfert en plastique. Ajouter 3ml d'hydroxyde d'ammonium par 100 mm de boîte et incuber à température ambiante pendant 5 min. Au cours de la période d'incubation de 5 min, agiter doucement la capsule chaque minute pour assurer la lyse de toutes les cellules. Les étapes 1.4-1.7 sera également réalisée dans la hotte d'aspiration. Remarque: Une élimination alternative cellulaire réactifs comprennent 2 M ou 8 M d'urée, qui sont mis en incubation avec les cellules pendant 10 min. Ajouter une grande quantité de de-ionisé H 2 O à chaque plat, au moins 20 ml par boîte de 100 mm, avec bascule. Disposer de l'hydroxyde d' ammonium solubilisé matériau qui est composé d'hydroxyde d'ammonium, les cellules lysées et déionisée H 2 O par aspiration avec une pipette de transfert. Transférer cette solution de déchets dans un conteneur pour déchets liquides. Laver la couche d'ECM insoluble dans abondante de-ionisé H 2 O quatre fois plus pour assurer l'élimination complète de tout le matériel d'hydroxyde-solubilisé ammonium. Pour l'examen de l'ECM par immunofluorescence, fixer l'ECM en ajoutant 2%paraformaldéhyde (PFA; 3 ml par boîte de 100 mm) à la température ambiante pendant 10 min. Attention: PFA est très dangereux en cas de contact avec la peau ou les yeux et la surexposition sévère peut provoquer des lésions pulmonaires, la suffocation, la perte de conscience, voire la mort. Il ne doit être manipulé dans une hotte, et de l'équipement de protection individuelle doit être porté. Laver chaque échantillon fixe deux fois avec PBS, comme dans l'étape 1.2, et de disposer de la solution PFA dans un conteneur de déchets liquides approprié. Le cas échéant, stocker les échantillons de l'ECM dans le PBS à 4 ° C avant de les préparer pour la microscopie par fluorescence. 2. Suivi des dépôts d'une protéine d'ECM par microscopie confocale Imagerie des cellules vivantes Compter les cellules sous un hémocytomètre. Pour cellules COS-7, la plaque 250.000 cellules sur une boîte de culture cellulaire de 60 mm pour la transfection. NOTE: Pour l'imagerie des cellules vivantes, les cellules doivent être transfectées avec un vecteur codant pour la protéine ECM d'intérêt, fusionnée dans le cadre d'une une fluorescence génétiquement codéstag nt. Ceci doit permettre l'identification de la protéine d'ECM d'intérêt lors de l'imagerie des cellules vivantes. Après un temps approprié pour l' expression des protéines (par exemple, 16 h) enlever les cellules de la boîte avec une solution de trypsine-EDTA, les compter dans un hémocytomètre et plaque ~ 150.000 cellules sur un plat de 35 mm maillées à fond de verre pour l' imagerie. Prévoir 2 h pour les cellules à rattacher et de commencer le dépôt d'ECM (la période de temps dépendra du type de cellule et doit être établie de manière empirique). REMARQUE: Utilisez un support de cellule qui ne contient pas de phénol rouge, comme cela peut donner une teinte rouge qui affecte la qualité de l'image. Au cours de la période de 2 h au- dessus, mis en place un microscope confocal avec une chambre de l' incubateur C 37 ° et une alimentation de CO 2. Laisser la température dans la chambre et dans la coupelle pour stabiliser à 37 ° C avant d'imagerie; cela peut prendre jusqu'à 1 h. Incuber les cellules étalées sur les 35 mm maillées plat avec un marqueur de cellule fluorescente pendant 30 min. Ensuite, laver les cellulesdeux fois en rouge de phénol libre du milieu de culture avant l'imagerie. REMARQUE: un marqueur fluorescent cytoplasmique peut être utilisé pour visualiser les volumes de cellule ou d'un marqueur membranaire incorporant peut être utilisé pour visualiser les bords de la cellule. Utilisation de l'objectif 20X et le contraste de phase sur un microscope confocal, identifier un carré de la grille appropriée qui contient un certain nombre (> 3) des adhérents, des cellules saines. Confirmer l'expression de la protéine cible de choix dans les cellules au sein de la place de la grille sélectionnée en utilisant les objectifs 63X ou 100X et les longueurs d'onde appropriées dans la microscopie par fluorescence. Mettre en place la fluorescence et contraste de phase time-lapse imagerie utilisant un logiciel z-stack. Placez la pile "Begin" pour être juste en dessous de la couche d'ECM et la pile "End" pour être juste au-dessus du corps cellulaire. Définir la taille z étape à 0,3 um et le volume z entre 5 et 10 um de profondeur au total, en fonction du type de cellule. Cela donnera entre 15-30 z sections par point de temps. Capture fluorescence (pour la protéine fluorescente rouge (RFP), excitation = 555 nm et émission = 584 nm) et des images à contraste de phase périodiquement sur une période de temps définie. Par exemple, utiliser le logiciel time-lapse pour définir l'intervalle de temps de 2 min et la durée à 2 h. Sélectionnez le bouton "start" pour commencer la capture de z-section des images sur la période de temps définie. A la fin de la période de temps, retirez les cellules du plat, comme décrit dans les étapes 1.1-1.5, pour confirmer la localisation de la protéine fluorescente marquée d'intérêt dans l'ECM. Utilisez l'imagerie à contraste de phase et l'objectif 20X de déplacer le carré de la grille pertinente. Passer à l'objectif 63X et identifier la couche d'ECM en microscopie à fluorescence. Comparer cette image à l'image pré-extraction 3. Préparation stérile de l'ECM de cellules dérivées de cellules tests fonctionnels Cultiver une population de cellules (les cellules "de producteurs de la matrice") sur des lamelles et une autre population (les cellules "test") en culture standard dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm pendant au moins 24 h. NOTE: Ceux-ci peuvent être de deux types de cellules adhérentes des différentes, et la conception expérimentale peuvent inclure la transfection des populations un ou les deux cellules pour exprimer une protéine d'ECM par fluorescence marquée. Dans une hotte à flux laminaire, tel qu'il est utilisé pour la culture cellulaire, de préparer des solutions stériles de PBS sans Ca2 + / Mg2 +, l' hydroxyde d' ammonium 20 mM (voir étape 1.3) et déionisée H 2 O en faisant passer chacun à travers un filtre stérile de 0,2 filtre pm dans un récipient stérile approprié. Maintenir une technique stérile, laver délicatement les cellules "productrices de matrice" sur des lamelles à trois reprises avec du PBS stérile (voir étape 1.2). Retirez le PBS par aspiration avec une pipette stérile et d'en disposer dans un récipient à déchets approprié. Ajouter 20 mM d'hydroxyde d'ammonium stérile (3 ml / 100 mm plat) et incuber pendant 5 minutes à bascule à intervalles réguliers. Ajouter des quantités copieusesdes stériles de-ionisé H 2 O au «producteur de matrice" plat, au moins 20 ml par boîte de 100 mm, avec bascule et videz le lysat cellulaire dans un conteneur à déchets approprié. Répétez l'étape 3.5 quatre fois de plus pour assurer l'élimination complète du matériau d'hydroxyde solubilisé ammonium. NOTE: L'ECM déposé par les cellules "productrices de matrice" sur les lamelles fournit alors un ECM stérile pour des tests fonctionnels avec des cellules d'essai d'intérêt. Incuber les cellules de test à partir de la boîte de cellule mère avec 1,5 ml de solution de trypsine-EDTA par boîte de 100 mm (0,05% p / v de trypsine et 0,02% p / v d'EDTA dans une solution saline équilibrée de Hank) jusqu'à ce que les cellules d'essai sont détachées de la boîte . Ajouter milieu cellulaire, centrifuger les cellules de test à 400 g pendant 5 min, et enlever le liquide surnageant. Resuspendre les cellules de test dans un milieu frais, stérile et les compter dans un hémocytomètre. Plaque d'un nombre approprié de ces cellules d'essai sur l'ECM isolé stérile coverslips. La culture dans leur milieu cellulaire approprié pour 2-3 heures, ou pendant la période de temps nécessaire à la conception expérimentale. Pour examiner l'organisation du cytosquelette d'actine, fixer les cellules de test dans 2% PFA et les tacher avec isothiocyanate de fluorescéine (FITC) -phalloidin (excitation = 490 nm et émission = 525 nm) pour visualiser F-actine et 4 ', 6 -diamidino-2-phénylindole (DAPI; excitation = 358 nm et émission = 461 nm) pour visualiser les noyaux 11. REMARQUE: comparer la morphologie et l'organisation d'actine dans les cellules d'essai étalées sur ECM hétérologue provenant d'une cellule d'essai avec des cellules plaquées sur leur propre ECM. 4. Isolement de l'ECM pour SDS-PAGE, analyse immunoblot, ou Proteomics Cultiver les cellules adhérentes d'intérêt sur 100 mm boîtes de culture cellulaire (5 à 10 plats pour la protéomique ou 1-2 plats pour immunoblot) pour 24-96 h, le cas échéant pour le type de cellules, pour permettre la sécrétion et le dépôt de l'ECM. Retirez les cellules que described dans les étapes 1,1-1,5. Inclinez chaque plaque à un angle de vidanger H 2 O résiduel au fond du plat, et retirez soigneusement toute H restante 2 O avec une pipette P200 jusqu'à ce que la plaque soit complètement sèche. En parallèle, un tampon d'échantillon SDS-PAGE thermique contenant du dithiothréitol 100 mM (DTT) à 95 ° C pendant 2 minutes en utilisant un bloc de chaleur, puis l'ajouter à la plaque. 200 pi de tampon d'échantillon par 100 mm de plaque est approprié pour les échantillons à examiner par immunoblot. Afin d'analyser l'ECM par spectrométrie de masse pour obtenir un échantillon plus concentré en recueillant le tampon d'échantillon SDS-PAGE de la capsule (comme décrit dans les étapes 4.5 et 4.6 ci-après), on re-chauffer à 95 ° C, et en utilisant la même partie aliquote de l'autre côté 2-3 plaques supplémentaires. Utilisez un grattoir cellulaire pour gratter soigneusement l'ECM hors du plat, en veillant à ce que tous les domaines de l'antenne ont été grattées. Avec le racleur de cellules, de recueillir l'échantillon d'un côté du plat et retirez-le avec un 200uL pointe de la pipette dans un tube. Transférer les SDS-PAGE extrait de tampon d'échantillon résiduel de la pointe de grattoir à cellules dans le tube pour minimiser la perte de matériel ECM. Pour un échantillon concentré, re-chauffer le même SDS-PAGE aliquote de tampon d'échantillon à 95 ° C et ré-utiliser dans 2-3 plaques supplémentaires. Résoudre les protéines ECM par SDS-PAGE à 12, en utilisant soit juillet 4 à 7% de gels à gradient de Polyacrylamide% ou moins . NOTE: Il est commode d'utiliser des marqueurs de protéines pré-colorées. Pour augmenter la résolution des protéines ECM haut poids moléculaire, prolonger le temps de gel de roulement de telle sorte que le marqueur de poids moléculaire 37 kDa fonctionne à proximité du fond du gel et des marqueurs de poids moléculaire <37 kDa sont enfuis du gel. Pour l'analyse protéomique des protéines ECM, tacher le gel avec une tache de protéine et capturer une image. Couper les bandes d'intérêt à partir du gel, les digérer avec de la trypsine, et de les analyser par désorption laser assistée par matrice / ionisation (MALDI) par spectrométrie -mass <sup> 13. Sinon, pour une analyse plus complète de l'extrait d'ECM et d'analyser l'ensemble de l' échantillon, couper la voie de gel dans les sections, les digérer avec de la trypsine, et effectuer la spectrométrie de chromatographie en masse liquide (LC-MS) 14. Sinon, pour immunotransfert 15, transférer des protéines du gel SDS-PAGE sur le fluorure de polyvinylidène (PVDF) à 15 V pendant au moins 1 h 10 min (méthode semi-sèche) pour assurer le transfert des protéines ECM haut poids moléculaire . Visualisez la protéine totale transférée à la membrane avec une tache Ponceau S. Suite à l' étape 4.11, utiliser des anticorps pour établir la présence et / ou de faire une analyse semi-quantitative des protéines ECM individuels 15. Bloquer la membrane avec 2% (p / v) de lait dans du TBS-Tween 20 (tampon de blocage) pendant une nuit à 4 ° C. Diluer les anticorps spécifiques aux protéines de l'ECM dans le tampon de blocage et on incube la membrane pendant 1,5 h à la température ambiante (anticorps fibronectin dilué 1/600 et un anticorps de la thrombospondine-1 dilué au 1/150; Tableau complémentaire 1). Tester la qualité de l'isolement de l'ECM par re-sonder la même empreinte avec des anticorps dirigés contre des protéines intracellulaires abondantes telles que l'actine ou la tubuline (anti-actine dilué au 1 / 10.000 et anti-tubuline dilué à 1 / 5.000).

Representative Results

Le protocole décrit dans les étapes 1.1-1.5 agit pour éliminer les cellules et de laisser derrière l'ECM dérivé des cellules. Le protocole a été réalisé sur des cellules COS-7 cultivées pendant 96 h sur des lamelles de verre, et l'ECM dérivé des cellules a été analysée par microscopie de fluorescence. Le traitement par l' hydroxyde d'ammonium élimine efficacement les cellules, tel que défini par la perte des noyaux cellulaires et le cytosquelette d' actine, selon le DAPI et phalloïdine coloration, respectivement (figure 1). L'extraction des cellules avec 2 M d'urée n'a pas été aussi efficace que l'hydroxyde d'ammonium; traces de DAPI et phalloidin coloration ont été détectés après le traitement. 8 M d' urée a eu un effet similaire à celui de l' hydroxyde d'ammonium (figure 1). Ensuite, ECM dérivé des cellules a été visualisée avant et après le traitement à l'hydroxyde d'ammonium (étapes 2.1 à 2.11). Les cellules COS-7 ont été transfectées avec une protéine fluorescente rouge monomère (mRFP) -tagged thrombospondine-1 C-terminale trimère (mRFPovTSP1C) 11 et cultivé sur un plat de 35 mm avec une base de verre grillagé. Deux heures après placage, un carré de grille appropriée qui contenait plusieurs cellules saines exprimant mRFPovTSP1C a été visualisées sous un microscope confocal. Une image de contraste de phase de référence a été prise de cette zone, puis l' imagerie de fluorescence time-lapse a été effectué toutes les 1 min pendant 2 h (figure 2A). Les cellules ont ensuite été éliminées à l'aide d'hydroxyde d'ammonium, et le même carré de la grille sur le plat a été relocalisés en contraste de phase et ensuite ré-analysés par microscopie à fluorescence. Les cellules ne sont plus présents dans le carré de la grille, mais mRFPovTSP1C sont restés dans l'ECM, détectée par microscopie à fluorescence comme puncta caractéristique (figure 2A). Tout mRFPovTSP1C déposé dans l'ECM avant le retrait de la cellule a été identifiée en comparant le pré de motif de fluorescence et post-élimination des cellules. Le puncta fluorescent identifié dans les deux images (Figure 2A, par exemple indiqué par une flèche) sont déduites d'être associés à l'ECM. traitement par l'hydroxyde d'ammonium a été ensuite utilisée pour isoler l'ECM natif à partir des cellules cultivées, adhérentes. fibroblastes dermiques humains (HDF) ont été cultivées sur des lamelles de verre pour 96 h. Les cellules ont été éliminées à l' aide d' hydroxyde d'ammonium, et l'ECM a été sondé avec un anticorps anti-I du collagène, qui a démontré une coloration fibrillaire et meshwork motif caractéristique 16 (figure 2B). Formation de motifs de la fibronectine a été examiné, des cellules fixes autour de la non-perméabilisées chondrosarcome de rat (RCS) et à l'intérieur de l'ECM , après élimination des cellules RCS (figure 2C). L'isolement de l'hydroxyde d'ammonium, de l'ECM est également réalisée dans des conditions stériles de telle sorte que les cellules «test» pourraient être ré-étalées sur l'ECM pour phénotypiques des études fonctionnelles. Par exemple, "test" cellules COS-7 ont été ensemencées pendant 2 h sur ECM stérile produite par les cellules RCS, et tpoule ont été fixées, perméabilisées et analysés pour déterminer l' organisation d'actine par FITC-phalloïdine coloration, par rapport aux cellules COS-7 produisent leurs propres ECM (étapes 03.01 à 03.09) (figure 3). A une échelle plus grande, la méthode a été utilisée pour isoler l'ECM pour des procédures biochimiques. Par exemple, les cellules ont été cultivées sur RCS deux boîtes de culture cellulaire de 100 mm pendant 7 jours, et les procédures décrites dans les étapes 4.1-4.7 ont été suivies. Les protéines présentes dans l'ECM dérivé des cellules ont été recueillies en les grattant dans un tampon d'échantillon de SDS-PAGE à chaud et ont été séparés par SDS-PAGE sur un gel de Polyacrylamide à 7% dans des conditions réductrices. Le gel a été coloré pour les protéines, et les quatre bandes principales ont chacune été isolé et analysé par spectrométrie de masse (figure 4A). Un certain nombre de protéines de la MEC, notamment la fibronectine, la thrombospondine 1 (TSP1), la thrombospondine 5 / cartilage oligomérique protéine de matrice (TSP5 / COMP) et matrilin-1 ont été identifiés (figure 4B). En variante, des préparations à petite échelle de l'ECM peuvent être évalués par immunoblots. Par exemple, l' ECM provenant d'une cellule de cellules COS-7 exprimant de manière ectopique mRFPovTSP1C a été séparé par SDS-PAGE, transférés sur une membrane en PVDF et sondé pour DP avec un anticorps anti-DP (figure 4C). Cette technique est suffisamment sensible pour détecter des différences dans les dépôts entre un trimère natif de TSP1 (mRFPovTSP1C) et une ingénierie pentamère de la région TSP1 C-terminal (mRFP-TSP-5-1c) 17 (figure 4C). Afin d'étudier l'ECM endogène de HDF, la présence de protéines spécifiques dans le lysat cellulaire ou l'ECM isolé a été étudiée par immunotransfert. La caractéristique des protéines ECM fibronectine et la thrombospondine-1 ont été détectés dans l'ECM, alors que les protéines intracellulaires abondantes α-β-tubuline et l' actine étaient absents de l'ECM isolé (figure 4D). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figure 1: Comparaison des méthodes de cellule enlèvement. Cellules COS-7 ont été cultivées à haute densité pour 96 h sur des lamelles, fixés à 2% PFA, et perméabilisées dans 0,5% de Triton X100, ou ont été traités comme indiqué pour l'élimination des cellules. Lamelles ont ensuite été colorées avec FITC-phalloïdine pour visualiser F-actine et DAPI pour visualiser les noyaux. Barre d'échelle = 25 pm. Ce chiffre est modifié à partir d' une publication originale dans le Journal of Cell Science 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Identification des protéines ECM dans ECM Isolated. (A) à contraste de phase et de fluorescence des images deCellules COS-7 exprimant mRFPovTSP1C et cultivées sur un plat de 35 mm avec une base grillagée à fond de verre pendant 2 h. Les images sont présentées avant et après l'élimination des cellules par de l'hydroxyde d'ammonium. Le bord de la lettre de la grille est indiquée dans les images à contraste de phase avec une ligne en pointillés. Les flèches blanches indiquent des exemples de puncta fluorescent qui étaient présents avant et après le retrait de la cellule. (B) Détection de collagène I en HDF ECM par immunofluorescence indirecte. HDF ont été cultivées pendant 96 h, éliminé avec de l'hydroxyde d'ammonium, et l'ECM a été colorée pour I humaine de collagène fibrillaire L'ECM a également été colorées avec un anticorps secondaire anti-lapin conjugué à FITC seul. (C) La localisation de la fibronectine dans les cellules ou dans RCS isolé RCS ECM, tel que détecté par immunofluorescence indirecte. RCS cellules ont été cultivées pendant 48 h, fixées dans 2% de PFA, et colorées pour la fibronectine et avec du DAPI. Dans les plats parallèles, les cellules ont été éliminées avec 20 mM d'hydroxyde d'ammonium et l'ECM a été colorées pour la fibronectin et avec du DAPI. Les cellules ont été également colorées avec un anticorps anti-IgG de souris conjugué au FITC seul. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: Utilisation de Stérile ECM pour les études fonctionnelles. RCS cellules "productrices" de la matrice ont été cultivées pendant 48 h sur des lamelles de verre et ensuite traitée avec de l'hydroxyde d'ammonium à 20 mM dans des conditions stériles afin d'éliminer les cellules. des cellules COS-7 "test" ont été étalées sur des lamelles couvre-objet avec ou sans isolement RCS ECM pendant 2 h, fixé dans 2% de PFA, perméabilisées dans 0,5% de Triton X100 et colorées avec du FITC-phalloïdine pour visualiser l'actine F et DAPI pour visualiser les noyaux . COS-7 cellules étalées sur RCS ECM réparties plus largement et forment de grands faisceaux de microfilaments (exemple fléchée) et le bord ruffles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: Identification des protéines d'ECM isolé par SDS-PAGE, la spectrométrie de masse, ou immunotransfert. (A) Les cellules ont été cultivées RCS pendant 7 jours et éliminés avec l' hydroxyde d' ammonium à 20 mM; l'ECM a été raclé dans un tampon d'échantillon chaud SDS-PAGE contenant 100 mM de DTT. La préparation de l'ECM a été séparé par SDS-PAGE sur un gel de Polyacrylamide à 7% dans des conditions réductrices. Quatre bandes significatives (flèches 1-4) ont été identifiés par la coloration des protéines. (B) Les protéines de RCS bandes ECM 1-4 ont été identifiées par spectrométrie de masse MALDI. (C) cellules COS-7 exprimant soit mRFPovTSP1C (trimère) ou mRFP-TSP-5-1c (pentamère) ont été cultivées pendant 48h et enlevé avec mM d'hydroxyde d'ammonium 20, et l'ECM a été isolé dans un tampon d'échantillon SDS-PAGE chaud contenant 100 mM de DTT. La préparation de l'ECM a été séparé par SDS-PAGE sur un gel de Polyacrylamide à 7% dans des conditions réductrices, transféré sur une membrane en PVDF et sondé avec un anticorps anti-DP. Ce panneau est modifié à partir d' une publication originale dans Bioscience Reports 17. (D) HDF ont été cultivées pendant 96 h, puis traitée soit avec de l' acide désoxycholique à 2% dans du PBS (lysat cellulaire) ou avec l' hydroxyde d' ammonium à 20 mM pour éliminer les cellules. L'ECM a été grattée dans le tampon d'échantillon SDS-PAGE à chaud. Les deux fractions ont été séparées par SDS-PAGE sur un gel de polyacrylamide 10% dans des conditions réductrices, transféré sur une membrane en PVDF et sondé avec des anticorps, comme il est indiqué. Dans chaque panneau, les positions des marqueurs de poids moléculaire sont indiqués en kDa. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figurer.

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

La méthode a quelques étapes essentielles qui doivent être suivies pour assurer l'isolement réussi et l'analyse des ECM. Par exemple, l'hydroxyde d'ammonium est utilisé pour éliminer les cellules et isoler l'ECM pour l'analyse. Bien que l'hydroxyde d'ammonium est stable dans des solutions aqueuses dans l'obscurité, et peut être conservé à la température ambiante, les bouteilles doivent être hermétiquement refermés après chaque utilisation. Parce que le gaz peut s'évaporer de la solution, réduisant ainsi la concentration, nous recommandons fortement de commencer une nouvelle bouteille toutes les 6-8 semaines. En outre, la solution de travail doit être fraîchement pour chaque expérience. Il est également essentiel que les cellules sont entièrement éliminés avec des lavages abondants dans de l'eau déminéralisée. Si ces étapes ne sont pas effectuées de manière adéquate, la matière cellulaire peut rester sur le plat et contaminer des analyses en aval. Si les cellules ont été cultivées pendant 10 jours ou plus, lavages à l'eau supplémentaires peuvent être nécessaires. Il est important de note que la couche d'ECM isolé est généralement très mince par rapport aux cellules 11, si les soins sont nécessaires lors de l' identification de l'ECM lors de l' imagerie. Pour une extraction efficace de l'ECM isolé dans un tampon échantillon SDS-PAGE, il est essentiel que le tampon d'échantillon contient un agent réducteur. Pour l'élimination la plus efficace de l'ECM, un tampon d'échantillon bouillant chaud doit être utilisé. Pour les expériences dans lesquelles des échantillons d'ECM seront résolus par électrophorèse SDS-PAGE pour la coloration de protéine ou protéomiques, il est essentiel d'obtenir un échantillon concentré en grattant plusieurs plaques d'une valeur de l'ECM dans la même partie aliquote de tampon d'échantillon.

Modifications et dépannage

La production et la sécrétion de protéines d'ECM peuvent varier considérablement entre les différents types de cellules, de sorte que les périodes de temps pour la sécrétion et le dépôt d'ECM doivent être déterminées de novo pour chaque type de cellule. Il est également important d'être conscient que la composition ECM va changer dynamiquement en relation to la densité cellulaire et le temps dans la culture 18. Ce facteur doit être pris en compte lors de la conception des expériences. Il est clair que le choix d'un type de cellule pour cette méthode est importante, en particulier lors de l'extraction ECM pour une analyse par spectrométrie de masse, ce qui peut nécessiter une quantité importante de protéines d'ECM totale.

Limites de la technique

Des cellules qui sécrètent des niveaux très faibles de protéines d'ECM seront plus difficiles à utiliser avec cette méthode. Les cellules non adhérentes, des cultures cellulaires en 3D ou des essais d'invasion cellulaire ne conviennent pas à l'heure actuelle pour l'isolement de l'ECM par cette méthode. Le procédé est particulièrement adapté pour être utilisé avec des cultures de cellules standard "2 dimensions". Étant donné que l'extraction de l'hydroxyde d'ammonium élimine les cellules complètement ECM associés aux faces supérieures des cellules et sécrétées, mais non réticulé, les protéines d'ECM sont également éliminés, en laissant sur le plat d'une couche mince d'ECM assemblé à partir d'au-dessous et autour des bases des cellules 11,17 </sup>. Il est complexe de quantifier la quantité de l'ECM est libéré par l'extraction de l'hydroxyde d'ammonium, parce que le matériau libéré comprend également des protéines ECM qui sont intracellulaire soit avant soit après la sécrétion de l'absorption à partir de la surface cellulaire.

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives

La capacité de mener une vaste gamme d'expériences avec ECM isolé est important dans le contexte de la biologie cellulaire et de la physiologie du tissu, et il a également des implications pour les domaines de la régénération des tissus et l'ingénierie tissulaire. Le procédé présente des avantages sur des gels formés à partir de collagènes purifiés ou d'autres protéines ECM purifié en ce que les cellules se rassemblent les structures ECM complexes à leur taille d'origine, avec des mécanismes de reticulation natifs et des protéines ECM individuels présents dans des rapports appropriés pour le type d'origine cellulaire. Par exemple, l'étude protéomique de RCS ECM démontré matrilins abondantes et COMP / TSP5, comme prévu pourun ECM cartilagineux 19,20 (figure 4). D'une manière générale, l'analyse de l'ECM provenant d'une cellule est entravée par sa nature un réseau étendu et multi-protéique qui se traduit par une reticulation covalente et l'insolubilité de nombreuses protéines d'ECM, et aussi par la contamination potentielle de l'ECM extrait avec des protéines intracellulaires. Une procédure en plusieurs étapes visant à isoler la fraction d'ECM à partir de tissus pour l' analyse protéomique a abouti à 8% de protéines d'ECM dans l'ensemble total des protéines identifiées 21. Cependant, les peptides provenant de protéines d'ECM étaient de 73% du total des peptides identifiés. Cette méthode pour l'isolement et l'analyse de l'ECM provenant d'une cellule rapide et fiable enlève de la matière cellulaire, tout en conservant les protéines d'ECM. Cette méthode peut être utilisée pour toute une gamme de types de cellules et les applications en aval et facilite l'analyse des interactions ECM de la biologie cellulaire et de l'ECM dans une culture cellulaire. Nos protocoles détail comment la méthode peut être appliquée à différentes échelles pour traiter un large éventail de expdes questions erimental en ce qui concerne l'organisation ECM, la dynamique, ou de la composition, et les effets fonctionnels de l'ECM isolé sur les cellules.

Applications futures ou les directions après la maîtrise de cette technique

Pour l'avenir, la méthode pourrait être adaptée pour une utilisation avec des cultures de cellules en 3D; ce serait d'élargir sa pertinence physiologique. Tissu natif décellularisé a un grand potentiel comme un échafaudage pour la régénération des tissus perdus ou endommagés et comme une alternative à la transplantation, comme après l' insuffisance cardiaque 22. Il a le potentiel pour surmonter les problèmes de disponibilité des donateurs et immunorejection. Les applications futures de la méthode décrite dans le présent rapport peuvent étudier son utilisation avec des cultures de cellules 3D ou décellularisation de tissu, ce qui augmenterait encore la portée de cette approche.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes très reconnaissants au Dr Belinda Willard, protéomique et métabolomique Laboratory, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, pour mener l'analyse protéomique du RCS ECM. Nous reconnaissons l'appui financier du theMedical Research Council du Royaume-Uni, le numéro K018043 accorder à JCA.

Materials

Antibody to COL1A1 Novus NB600-408 Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I.  IF:  1/200 
Antibody to fibronectin Sigma F3648 Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200
Antibody to thrombospondin 1  ThermoFisher  MA5-13398 Mouse monoclonal clone A6.1.  WB: 1/150 for 1.5 hr
Antibody to RFP Abcam ab62341 Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr
Antibody to β-actin Sigma A1978 Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr 
Antibody to α-tubulin Sigma T9026 Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr
Cell Tracker Green ThermoFisher  C2925 Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin Sigma P-5282 Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG Sigma F8771 IF: 1/50 for 1 hr
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG SIgma F7512 IF: 1/50 for 1 hr
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG LI-COR 926-80010 WB: 1/50000 for 1 hr
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG LI-COR 926-80011 WB: 1/100000 for 1 hr
Vectorshield mounting medium with DAPI Vector H-1200 Store at 4 C in the dark
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma D6429 Warm before use
Fibroblast growth medium PromoCell C-23010 Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid
Phenol red-free DMEM ThermoFisher  21063-029 Warm before use
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 Warm before use
Gridded glass-bottomed dish MatTek P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, 28% – 30%  solution Sigma 221228 Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. 
Paraformaldehyde, 16 % solution Alfa Aesar 43368 Dilute to 2 % (v/v) in PBS
Deoxycholic acid Sigma D2510 Use at 2 % (v/v) final concentration
Triton X-100 Sigma T8787 Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration
GelCode Blue stain reagent ThermoFisher  24590 Protein stain for SDS-PAGE gels
Precision Plus protein standards Biorad 161-0374 Protein standards for SDS-PAGE gels
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell Biorad 1703940 Efficient transfer of high molecular weight proteins
PVDF transfer membrane Millipore ISEQ00010 Immobilon-PSQ 
Ponceau S stain Sigma P7170 Reversible protein stain for PVDF membrane
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate LI-COR 926-80200
High performance chemiluminescence film GE Healthcare 28906837
Sterile filtration unit, MILLEX-GV Millipore ML481051
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope Leica Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)
Key: IF, Immunofluorescence;
WB, Western Blot
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Riferimenti

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Hellewell, A. L., Rosini, S., Adams, J. C. A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (119), e55051, doi:10.3791/55051 (2017).
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