細胞由来の細胞外マトリックスの急速な、単離、機能性研究のためのスケーラブルな方法、および分析

水酸化アンモニウム溶液による細胞の1取り外し適切な密度でプレーティングすることによって接着細胞を準備します。 注：細胞は、分析のための十分なECMを生成する任意の接着細胞タイプにすることができます。ここでは、COS-7細胞、SV-40ウイルスDNA配列を含む、アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞様細胞株の使用を記載しています。 RCSラット軟骨肉腫細胞株。または正常ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）は、少年包皮から株。 HDFは、通路1から通路8のみに使用されています。 板生細胞とECMのイメージングのため、固定されたECMの蛍光顕微鏡研究のための、または小規模な機能アッセイのための細胞由来のECMの製造のためのカバースリップ上の細胞。 SDS-PAGE分析を、免疫ブロット、またはプロテオミクス研究のための細胞培養皿に細胞をプレート。 注：細胞培養条件（プレートに細胞および培地の数）は、細胞のタイプに依存します。プレートに細胞数のことを行う必要があります特定の細胞株または細胞株について経験的に確立されます。 典型的には> 16時間、細胞がECMを堆積するのに適した時間を許可します。注：時間は、細胞型に依存し、経験的に決定される必要があります。異所性発現を行った場合は、目的のトランスフェクトされたタンパク質の発現およびECMの沈着のための適切な時間を与えます。 換気扇では、脱イオンH 2 Oで原液1/14に希釈して適当な容器に20 mMの水酸化アンモニウムを準備インキュベーターから細胞を取り出して、そっと培地を除去します。静かに皿の壁に注入することによって2+ / MgのCa 2+をすることなく、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。二回皿をロックし、プラスチック製のトランスファーピペットで液体を除去します。二回以上繰り返します。 抽出フードでは、各皿を傾け、プラスチック製のトランスファーピペットでステップ1.2からPBSを削除します。 3を追加100-mmディッシュ当たり水酸化アンモニウムmLの、5分間室温でそれらをインキュベートします。 5分間のインキュベーション期間中、穏やかにすべての細胞の溶解を確実にするために皿毎分攪拌します。ステップ1.4~1.7はまた、抽出フード内で行われます。 注意：代替細胞除去剤は、10分間、細胞と共にインキュベートされる2 M又は8 M尿素を含みます。 ロッキングで、100ミリメートル皿当たり少なくとも20ミリリットル、各皿に脱イオンH 2 O大量のを追加します。水酸化アンモニウム可溶化材料-水酸化アンモニウム、溶解した細胞、および脱イオンH 2 O-による転送ピペットで吸引で構成されて廃棄してください。液体廃棄物用の容器の中に、この廃液を転送します。 すべての水酸化アンモニウム可溶化物質の完全な除去を確実にするために大量の脱イオンH 2 O 4回以上の不溶性ECM層を洗浄します。 免疫蛍光法によってECMの検査のために、2％を追加することにより、ECMを修正パラホルムアルデヒド（PFA; 100 mmディッシュ当たり3 mL）で10分間室温で。 注意：PFAは、皮膚や目に接触し、肺の損傷、窒息、意識不明、または死亡を生成することができます深刻な露出オーバーの場合は非常に危険です。それだけ抽出フード内で扱われるべきであり、個人用保護具を着用する必要があります。 ステップ1.2のように、PBSで2回各固定サンプルを洗浄し、適切な廃液容器にPFA液を処分。必要であれば、蛍光顕微鏡検査のためにそれらを準備する前に、4℃でPBSにおけるECMサンプルを格納します。 生きた細胞の共焦点顕微鏡イメージングによって、ECMタンパク質の2トラッキング沈着血球計数器で細胞をカウントします。 COS-7細胞は、トランスフェクションのための60mmの細胞培養皿に250,000細胞をプレート。 注：生細胞イメージングのために、細胞は、対象のECMタンパク質をコードするベクターでトランスフェクトされる必要があり、遺伝的にコードされた蛍光を発するとインフレームで融合ntのタグ。これは、生細胞画像化の間に関心のECMタンパク質の同定を可能にすることです。 イメージング用の35 mmのグリッド化、ガラス底の皿にタンパク質発現（ 例えば、16時間）に適した時間の後、トリプシンEDTA溶液でディッシュから細胞を除去し、血球計数器でそれらをカウントし、プレート〜15万細胞。細胞のための2時間は、再接続すると（時間は細胞型に依存し、経験的に確立されなければならない）ECM沈着を開始することを許可します。 注：これは画質に影響を与える赤の色合いを与えることができるように、フェノールレッドを含まない細胞培地を使用してください。 上記の2時間の期間中、37℃のインキュベーター室およびCO 2供給と共焦点顕微鏡を設定します。チャンバー内の皿の温度が撮影前に37℃に安定化させます。これは、1時間ほどかかる場合があります。 30分間の蛍光細胞マーカーと35ミリメートルグリッド化皿に播種した細胞をインキュベートします。その後、細胞を洗浄二回、フェノールレッドを含まない培地での撮像前に。 注：細胞質の蛍光マーカーは、細胞容積を視覚化するために使用することができ、または膜組み込みマーカーは、セルの端を視覚化するために使用することができます。 共焦点顕微鏡で20X対物レンズと位相コントラストを使用して、接着性、健康な細胞の数（> 3）を含む適切なグリッドの正方形を識別します。 63Xまたは100X目的や蛍光顕微鏡下での適切な波長を使用して、選択したグリッド正方形内の細胞中の選択肢の標的タンパク質の発現を確認してください。 zスタックソフトウェアを使用して、蛍光および位相差タイムラプスイメージングを設定します。ちょうど細胞体以上であるためにちょうどECM層と「終了」スタックの下にあることを「開始」スタックを設定します。細胞の種類に応じて、合計で0.3ミクロンまでのzステップサイズと5〜10μmの深さの間にz軸音量を設定します。これは、時点ごとの15-30のzセクションの間に得られます。 CAPTUR（赤色蛍光タンパク質（RFP）のために、励起= 555 nmおよび発光= 584 nm）を位相コントラスト画像定期的に設定された時間期間にわたってE蛍光。例えば、2分の時間間隔、2時間の時間を設定するタイムラプスソフトウェアを使用しています。定義された期間にわたってのz断面画像のキャプチャを開始し、「開始」ボタンを選択します。 ECMへの関心の蛍光標識タンパク質の局在を確認するために、ステップ1.1から1.5に記載されているように、時間期間の終了時に、皿から細胞を除去します。 関連するグリッドの正方形を再配置する位相コントラストイメージングおよび20X対物レンズを使用してください。 63X対物レンズに切り替えて、蛍光顕微鏡下でECM層を識別します。抽出前の画像にこの画像を比較細胞機能アッセイのための細胞由来のECMの3無菌調製カバースリップし、別のPOPUの細胞（「マトリックスプロデューサー」細胞）の1の人口を育てます少なくとも24時間100ミリメートル細胞培養皿で標準的な培養中レーション（ "テスト"細胞）。 注：これらは、任意の二つの異なる接着性細胞型であることができ、実験設計は、蛍光タグECMタンパク質を発現するために、1つまたは両方の細胞集団のトランスフェクションを含むことができます。 滅菌0.2介しを通過させることによって、細胞培養のために使用されるように、層流フード内で、カルシウムを含まないPBSの無菌溶液を調製2+ / Mgの2+、20 mMの水酸化アンモニウム（ステップ1.3参照）、および脱イオンH 2 O適切な無菌の容器にミクロンフィルター。 滅菌技術を維持し、穏やかに無菌PBS（ステップ1.2参照）でカバーガラス上で3回「マトリックスプロデューサー」細胞を洗浄します。 滅菌ピペットを用いて吸引によってPBSを削除し、適切な廃液容器に入れて処分します。 20 mMの無菌水酸化アンモニウム（3mLの/ 100ミリメートル皿）を追加した間隔で揺り動かしながら5分間、それらをインキュベートします。 大量の追加滅菌脱イオンH 2 Oの「マトリックスプロデューサー」ディッシュ、100ミリメートル皿当たり少なくとも20ミリリットル、ロッキングであり、適切な廃棄容器に細胞溶解物を離れて注ぐします。 水酸化アンモニウム可溶化物質の完全な除去を確実にするための手順を繰り返し3.5 4回。 注：カバーガラス上で「マトリックスプロデューサー」細胞によって堆積ECMは、その後、目的の任意の試験細胞との機能的アッセイのための滅菌ECMを提供します。 試験細胞がディッシュから剥離されるまで、100ミリメートルディッシュ（ハンクス平衡塩溶液中のVトリプシン/ワット0.05％と0.02％のw / vのEDTA）当たりトリプシンEDTA溶液1.5mLを持つ細胞ストック皿からテスト細胞をインキュベート。 、細胞培地を追加し、5分間400×gで試験細胞を遠心分離し、上澄み液を除去します。 新鮮な、滅菌培地中の試験細胞を再懸濁し、血球計でそれらを数えます。 coversli上の滅菌は、単離されたECM上にこれらの試験適切な数の細胞をプレートpsの。 2-3時間、又は実験的設計のために必要な時間のための適切な細胞培地で培養して。 、アクチン細胞骨格の組織を調べ、2％PFAで試験細胞を固定し、フルオレセインイソチオシアネートとそれらを染色（FITC）-phalloidin（励起= 490 nmおよび発光= 525 nm）の「F-アクチンと4で可視化するために、6〜 -diamidino -2-フェニルインドール（DAPI;励起= 358 nmおよび発光= 461 nm）を核11を可視化します。 注：自分のECM上に播種し、試験細胞と異種細胞由来のECM上に播種し、試験細胞における形態とアクチンの組織を比較してください。 SDS-PAGE、イムノブロット分析、またはプロテオミクスのためのECMの4.絶縁分泌およびECMの沈着を可能にするために、細胞の種類に応じて、24〜96時間、100ミリメートル細胞培養皿（プロテオミクスのために5〜10の皿やイムノブロッティングのために1-2皿）の利息の接着細胞を成長させます。 DESCRなどの細胞を削除しますステップ1.1から1.5にibed。 皿の底に残留H 2 Oを排出する角度で各プレートを傾け、そしてプレートが完全に乾燥するまで慎重P200のピペットで、残りのH 2 Oを除去します。 並行して、熱SDS-PAGEサンプルバッファーをヒートブロックを用いて、2分間95℃で100mMのジチオスレイトール（DTT）を含有し、その後プレートに加えます。 100ミリメートルプレートあたりのサンプルバッファー200μLのは、イムノブロットによって検査されるサンプルに適しています。 質量分析によってECMを分析するために、それを95℃に再加熱し、（下記のステップ4.5および4.6に記載の）皿からSDS-PAGE試料緩衝液を収集し、そしてにわたって同じ一定分量を使用して、より濃縮されたサンプルを得ます2-3追加のプレート。 徹底的に皿のすべての領域が掻き取られていることを確認して、皿からECMをこすり取る際には、セルスクレーパーを使用してください。 セルスクレーパーで、皿の片側にサンプルを収集し、200でそれを削除しますチューブにμLピペットチップ。 ECM材料の損失を最小限にするためにチューブに細胞スクレーパー先端から残留SDS-PAGE試料緩衝液抽出物を移します。濃縮されたサンプルについて、95℃に同じSDS-PAGEサンプル緩衝液のアリコートを再加熱し、2-3追加の板を渡ってそれを再使用します。 7％または4ないし7％勾配ポリアクリルアミドゲルのいずれかを使用して、SDS-PAGE 12によってECMタンパク質を解決します。 注：これは、前染色タンパク質マーカーを使用すると便利です。 高分子量のECMタンパク質の分解能を高めるために、37kDaの分子量マーカーが近いゲルおよび分子量マーカー<37kDaのの下に実行されたゲルをオフに実行しているようなゲル走行時間を延長します。 ECMタンパク質のプロテオーム解析のため、タンパク質染色でゲルを染色し、画像をキャプチャします。ゲルから目的のバンドを切り取り、トリプシンを用いてこれらを消化し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI） – 質量分析によってそれらを分析<SUP> 13。 また、ECM抽出物のより包括的な分析のためと、全体のサンプルを分析セクションにゲルのレーンをスライスし、トリプシンでそれらを消化し、液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）14を実行します。 あるいは、15をイムノブロッティングのために、高分子量のECMタンパク質の移動を確保するために、少なくとも1時間10分（半乾式法）、15 Vでポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜にSDS-PAGEゲルからのタンパク質を転送します。ポンソーS染色で膜に転写し、全タンパク質を可視化します。 次のステップ4.11、プレゼンスを確立および/または個々のECMタンパク質15の半定量的分析を行うために抗体を使用します。 一晩4℃で2％のTBS-Tween 20を（ブロッキング緩衝液）中で（w / v）のミルクで膜をブロックします。ブロッキング緩衝液中でのECMタンパク質に特異的な抗体を希釈し、室温で1.5時間、膜をインキュベート（FIBする抗体ronectinは、トロンボスポンジン1 1/150希釈に1/600と抗体を希釈しました。 補足表1）。 このようなアクチンやチューブリン（抗アクチンは、1 / 10,000に希釈し、抗チューブリンは、1/5000に希釈）など豊富な細胞内タンパク質に対する抗体を用いて同じブロットを再プローブすることによってECM分離の品質をテストします。