Een snelle, schaalbare methode voor het isoleren, functionele studie en analyse van cel-afgeleide extracellulaire matrix

1. Verwijdering van Cellen met ammoniumhydroxideoplossing Bereid hechtende cellen door Plating in de juiste dichtheid. LET OP: De cellen kunnen alle aanhangend celtype dat er voldoende ECM produceert voor analyse. Hier beschrijven we het gebruik van COS-7-cellen, Afrikaanse groene aap nier fibroblast-achtige cellijn die SV-40 virus-DNA-sequenties bevat; RCS, een rat chondrosarcoom cellijn; of normale menselijke dermale fibroblasten (HDF) stammen uit juveniele voorhuid. HDF gebruik van passage 1 tot enige passage 8. Plaat de cellen op dekglaasjes voor beeldvorming van levende cellen en de ECM, fluorescentiemicroscopie studies van vaste ECM of voor de bereiding van cellen afgeleide ECM kleinschalige functionele bepalingen. Plate de cellen op celkweek gerechten voor SDS-PAGE-analyse, immunoblot of proteomics studies. OPMERKING: De celkweekomstandigheden (aantal cellen aan de plaat en kweekmedium) zal afhangen van het celtype. Het aantal cellen tot op het bord zal moetenempirisch worden vastgesteld voor de bepaalde cellijn of cellijn. Maken een geschikte tijd om de cellen te deponeren ECM, meestal> 16 uur. OPMERKING: De tijdsperiode hangt af van het celtype en moet empirisch worden bepaald. Indien bij ectopische expressie, zodat passende tijd voor de expressie van de getransfecteerde eiwit van belang en voor de afzetting van ECM. In een afzuigkap, Bereid 20 mM ammoniumhydroxide in een geschikt vat door verdunning van de Stock Solution 1/14 met gedeïoniseerd H 2 O. Verwijder de cellen van de incubator en verwijder voorzichtig kweekmedium. Add fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + / Mg2 + door langzaam gieten tegen de wanden van de schaal. Rock de schotel twee keer en verwijder de vloeistof met een plastic overdracht pipet. Herhaal dit nog twee keer. In een afzuigkap, kantelen elk gerecht en verwijder de PBS uit stap 1.2 met een plastic overdracht pipet. Voeg 3mL ammoniumhydroxide per 100 mm schaal en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Gedurende de 5 min incubatieperiode voorzichtig schudden de schotel elke min aan de lyse van de cellen te waarborgen. Stappen 1,4-1,7 zal ook in de afzuigkap worden uitgevoerd. OPMERKING: Alternatieve verwijdering cel reagentia omvatten 2 M en 8 M ureum, die zijn geïncubeerd met de cellen gedurende 10 min. Voeg overvloedige hoeveelheden gedeïoniseerd H2O elk gerecht, tenminste 20 ml per 100 mm schaal met schommelen. Gooi de ammoniumhydroxide-oplosbaar materiaal-dat uit ammoniumhydroxide, gelyseerde cellen en gedeïoniseerd H2O-door afzuigen met een transferpipet. Breng deze oplossing afval in een container voor vloeibaar afval. Was de onoplosbare ECM laag in overvloedige gedeïoniseerd H2O vier keer om de volledige verwijdering van de ammoniumhydroxide-oplosbaar materiaal te waarborgen. Voor het onderzoek van de ECM door immunofluorescentie, bevestig de ECM door toevoeging van 2%paraformaldehyde (PFA, 3 ml per 100 mm schaal) bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Let op: PFA is zeer gevaarlijk in geval van de huid of ogen en ernstige overbelichting kan longschade, verstikking, bewusteloosheid, of de dood veroorzaken. Het mag alleen worden behandeld in een afzuigkap en persoonlijke beschermingsmiddelen moeten gedragen worden. Was elk vaste monster tweemaal met PBS, zoals in stap 1.2, en gooi de PFA-oplossing in een geschikte bak vloeibaar afval. Indien nodig maakt ECM monsters in PBS bij 4 ° C voor te bereiden op fluorescentie microscopie. 2. Tracking Afzetting van een ECM-eiwit door confocale microscopie beeldvorming van levende cellen Tel de cellen onder een hemocytometer. Voor COS-7-cellen, plaat 250.000 cellen op een 60 mm celkweek schotel voor transfectie. Opmerking: Voor live cell imaging, moeten de cellen worden getransfecteerd met een vector die codeert voor het ECM eiwit van belang gefuseerd in frame met een genetisch gecodeerd fluorescerennt tag. Dit is de identificatie van de ECM eiwit van belang bij live-cell imaging inschakelen. Na een geschikte tijd voor proteïne-expressie (bijvoorbeeld 16 uur) te verwijderen van de cellen van de schaal met trypsine-EDTA-oplossing, ze tellen in een hemocytometer en plaat ~ 150.000 cellen op een 35-mm gerasterde, glazen bodem schotel voor beeldvorming. Laat 2 uur om de cellen weer vast en ECM afzetting beginnen (de tijdsperiode is afhankelijk van het celtype en dient empirisch te worden vastgesteld). LET OP: Gebruik een cel medium dat geen fenolrood bevat, omdat deze een rode tint die de beeldkwaliteit beïnvloedt kan geven. Tijdens de bovengenoemde periode van 2 uur, het opzetten van een confocale microscoop met een 37 ° C incubator kamer en een CO2-levering. Hierdoor kan de temperatuur in de kamer en in de schaal te stabiliseren tot 37 ° C voor de beeldvorming; Dit kan tot 1 uur. Incubeer de cellen uitgeplaat op de 35 mm gerasterde schotel met een fluorescerende cel marker voor 30 min. Vervolgens was de cellentweemaal in fenolrood-vrij kweekmedium voorafgaand aan beeldvorming. OPMERKING: Een cytoplasmatisch fluorescente merker kan worden gebruikt om celvolumes visualiseren of een membraan waarin marker kan worden gebruikt om celranden visualiseren. Met behulp van de 20X objectief en fase contrast op een confocale microscoop, identificeren een geschikte raster plein dat een aantal (> 3) hechtende, gezonde cellen bevat. Bevestigen de expressie van het doeleiwit keuze in de cellen in de geselecteerde rastervak ​​met de doelstellingen 63X en 100X en de juiste golflengtes onder fluorescentiemicroscopie. Opzetten fluorescentie en fase-contrast time-lapse beeldvorming met behulp van een z-stack software. Stel de "begint" stack net onder de ECM laag en het "einde" stack om net boven het cellichaam. Stel de z-stapgrootte 0,3 urn en de z-volume tussen 5 en 10 urn diepte in totaal, afhankelijk van het celtype. Dit zal tussen de 15-30 z-profielen per tijdstip geven. Capture fluorescentie (voor rood fluorescerend eiwit (RFP), excitatie = 555 nm en emissie = 584 nm) en fase-contrast beelden periodiek over een bepaalde periode. Gebruik bijvoorbeeld de time-lapse-software om het tijdsinterval op 2 min en de duur tot 2 uur in te stellen. Selecteert u de knop "start" om het vastleggen van z-sectie beelden beginnen over de gedefinieerde periode. Aan het einde van de periode, verwijderen van de cellen van schotel, zoals beschreven in stappen 1.1-1.5, de lokalisatie van de fluorescent gemerkt eiwit van interesse in de ECM bevestigen. Gebruik fase-contrast beeldvorming en de 20X objectief te verhuizen de desbetreffende raster plein. Overschakelen naar het 63x objectief en identificeren van de ECM laag onder fluorescentie microscopie. Vergelijk dit beeld Het beeld van de pre-winning tot 3. Steriele Voorbereiding van de Cell-afgeleide ECM for Cell functionele testen Grow een populatie van cellen (de "matrix producent" cellen) op dekglaasjes en andere popuordening (de "test" cellen) in standaardkweek in een 100 mm kweekschaal cel ten minste 24 uur. Opmerking: Dit kunnen twee verschillende hechtende celtypen en proefopzet kunnen omvatten transfectie van één of beide celpopulaties een fluorescent-gelabelde ECM-eiwit tot expressie. In een laminaire stroming kap, zoals gebruikt voor celkweek, voor te bereiden steriele oplossingen van PBS zonder Ca 2+ / Mg 2+, 20 mM ammonium hydroxide (zie stap 1.3), en de-geïoniseerde H 2 O door het passeren van elk door een steriel 0,2 um filter in een geschikte steriele container. Het handhaven van steriele techniek, voorzichtig te wassen de "matrix producent" cellen op dekglaasjes drie keer met steriele PBS (zie stap 1.2). Verwijder de PBS door aspiratie met een steriele pipet en gooi het in een geschikte houder vloeibaar afval. Voeg 20 mM steriel ammoniumhydroxide (3 ml / 100 mm schaal) en incubeer ze gedurende 5 minuten met tussenpozen schommelen. Voeg grote hoeveelhedensteriel gedeïoniseerd H 2 O aan de "matrix producent" schaal, ten minste 20 ml per 100 mm schaal, met schommelstoelen, en giet weg het cellysaat in een geschikte afvalcontainer. Herhaal stap 3,5 vier keer om de volledige verwijdering van de ammoniumhydroxide-oplosbaar materiaal te waarborgen. LET OP: De ECM door de "matrix producent" cellen afgezet op de dekglaasjes biedt dan een steriele ECM voor functionele assays met enige testcellen van belang. Incubeer de testcellen uit de cel stock schaal met 1,5 ml trypsine-EDTA-oplossing per 100 mm schaal (0,05% w / v trypsine en 0,02% w / v EDTA in gebalanceerde zoutoplossing Hank's) tot de testcellen worden losgemaakt van de schotel . Voeg cel medium, centrifuge de test cellen op 400 xg gedurende 5 minuten, en verwijder de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de testcellen in vers, steriel medium en tellen in een hemocytometer. Plate een passend aantal van deze testcellen op de steriele, geïsoleerde ECM op coverslips. Cultuur hen in de juiste cel medium voor 2-3 uur, of voor de tijd die nodig is voor de experimentele opzet. Om de organisatie van het actine cytoskelet te onderzoeken, bevestig de testcellen in 2% PFA en vlekken ze met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) -phalloidin (excitatie = 490 nm en emissie = 525 nm) te visualiseren F-actine en met 4 ', 6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI; excitatie = 358 nm en emissie = 461 nm) om de kernen 11 te visualiseren. Opmerking: Vergelijk de morfologie en actine organisatie in de test cellen op heterologe cellen afgeleide ECM met testcellen uitgeplaat op hun ECM. 4. Isolatie van ECM voor SDS-PAGE, immunoblotanalyse of Proteomics Grow hechtende cellen van de rente op 100 mm celkweek gerechten (5-10 gerechten voor proteomics of 1-2 gerechten voor immunoblotting) voor 24-96 uur, afhankelijk van het celtype, om secretie en afzetting van ECM mogelijk te maken. Verwijder de cellen als descrIBED in stappen 1,1-1,5. Kantelen elke plaat een hoek om resterende H 2 O afvoer aan de bodem van de schaal, en verwijder alle resterende H 2 O met een p200 pipet totdat de plaat volledig droog. Tegelijkertijd warmte SDS-PAGE monsterbuffer bevattende 100 mM dithiothreitol (DTT) tot 95 ° C gedurende 2 minuten met een verwarmingsblok en vervolgens toevoegen aan de plaat. 200 pl monsterbuffer per 100 mm plaat is geschikt voor monsters met immunoblot te onderzoeken. ECM door massaspectrometrie geanalyseerd, bereiken een meer geconcentreerde monster door het verzamelen van de SDS-PAGE monsterbuffer van de schaal (zoals beschreven in stap 4.5 en 4.6, hieronder), opnieuw te verwarmen tot 95 ° C, en met dezelfde hoeveelheid in 2-3 extra schotels. Gebruik een cel schraper om grondig te schrapen de ECM uit de schotel, ervoor te zorgen dat alle gebieden van het gerecht zijn geschraapt. Met celschraper verzamelen van het monster aan een kant van de schaal en verwijderen met een 200pi pipetpunt in een buis. De eventueel achtergebleven SDS-PAGE monsterbuffer uittreksel uit de cel schraperuiteinde in de buis om het verlies van ECM materiaal te minimaliseren. Voor een geconcentreerd monster, re-verwarmen hetzelfde SDS-PAGE sample buffer monster tot 95 ° C en opnieuw te gebruiken het over 2-3 extra borden. Los het ECM eiwitten door SDS-PAGE 12, met behulp van 7% of 4-7% gradiënt polyacrylamide gels. LET OP: Het is handig om pre-lood eiwit markers te gebruiken. De resolutie van het hoge molecuulgewicht ECM eiwitten, het beleid gel looptijd zodanig dat de 37 kDa molecuulgewicht merker loopt dicht bij de bodem van de gel en molecuulgewichtsmerkers <37 kDa werking van de gel. Voor proteomics analyse van ECM eiwitten, vlekken op de gel met een eiwit vlek en vastleggen van een beeld. Snijd banden van interesse van de gel, verteren ze met trypsine en analyseren door matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) -massa spectrometrie <sup> 13. Als alternatief voor een meer uitgebreide analyse van de ECM-extract en het gehele monster te analyseren, snijd de gel laan in secties, verteren ze met trypsine, en het uitvoeren van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) 14. Als alternatief voor immunoblotting 15, transfer eiwitten van de SDS-PAGE gel op polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan bij 15 V gedurende ten minste 1 h 10 min (semi-droge methode) de overdracht van het hoge molecuulgewicht ECM eiwitten garanderen . Visualiseren het totale eiwit overgebracht naar het membraan met Ponceau S kleuring. Na stap 4.11, gebruikt antilichamen om de aanwezigheid vast te stellen en / of een semi-kwantitatieve analyse van de individuele ECM eiwitten 15. Blokkeer het membraan met 2% (w / v) melk in TBS-Tween 20 (blokkerende buffer) overnacht bij 4 ° C. Verdun specifieke antilichamen ECM eiwitten in blokkerende buffer en geïncubeerd met het membraan gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur (antilichaam tegen fibronectin verdund 1/600 en antilichaam tegen thrombospondin-1 verdund 1/150; Aanvullende Tabel 1). Test de kwaliteit van de ECM isolatie door het opnieuw sonderen dezelfde blot met antilichamen tegen overvloedige intracellulaire proteïnen, zoals actine en tubuline (anti-actine verdund 1 / 10.000 en anti-tubuline verdund 1/5000).