一种快速，为隔离，功能可扩展的研究方法，以及细胞衍生的细胞外基质的分析

1.去除细胞与氢氧化铵溶液通过在适当的密度电镀准备贴壁细胞。 注：细胞可以是用于分析产生足够的ECM任何贴壁细胞类型。在这里，我们描述了使用COS-7细胞，它包含SV-40病毒DNA序列的非洲绿猴肾成纤维细胞样细胞系的; RCS，大鼠软骨肉瘤细胞系;或正常人真皮成纤维（HDF）从幼年包皮菌株。 HDF用于从通道1到唯一通道8。 板上盖玻片活细胞和ECM，对固定的ECM的荧光显微镜研究的摄像单元，或用于制备细胞衍生的ECM的小规模功能测定。板上进行SDS-PAGE分析，免疫印迹，或蛋白质组学研究细胞培养皿的细胞。 注：细胞培养条件（细胞板和培养基的数目）将取决于细胞类型。细胞数量板需要根据经验为特定细胞系或细胞株建立。 允许一个适当的时间，将细胞沉积的ECM，通常> 16小时。注：时间段将取决于细胞类型，将需要根据经验确定。如果导电异位表达时，允许合适时间感兴趣的转染蛋白的表达和细胞外基质的沉积。 在一个排油烟机，准备的20mM氢氧化铵在合适的容器通过与去离子H 2 O稀释该储备溶液1/14 从孵化器中取出细胞，并轻轻取出培养基。通过对盘的壁轻轻倒出不含Ca 2+ / Mg 2+离子添加磷酸盐缓冲盐水（PBS）。岩盘两次并用塑料移液管除去液体。重复两次。 在排油烟机，倾斜每一道菜，然后从步骤1.2用塑料移液管取出PBS。添加3每100毫米培养皿氢氧化铵中的溶液，并培育它们在室温下5分钟。在5分钟温育期，轻轻搅动菜每分钟，以确保所有的细胞的裂解。步骤1.4-1.7还将在排油烟机进行。 注：替代细胞去除试剂包括2 M或8M尿素，这是与细胞10分钟孵育。 丰富的金额去离子H 2的O添加到每一道菜，每100毫米的菜至少20毫升，用摇摆。氢氧化物溶解的材料，它由氢氧化铵，裂解的细胞，以及去离子H 2 O型通过用移液管抽吸处置铵。转让本废液转化为液体废物的容器。 在丰富的去离子H 2Ø四次洗不溶性ECM层，以确保彻底清除所有的氢氧化铵，溶解的材料。 对于通过免疫荧光ECM的检查，加入2％的固定ECM多聚甲醛（PFA;每100mm培养皿3mL）中在室温下10分钟。 注意：PFA是皮肤或眼睛接触和严重的过度曝光会产生肺部损伤，窒息，昏迷，甚至死亡的情况非常危险。它应该只在排油烟处理，和个人防护装备应戴。 用PBS洗每个固定的样品两次，如在步骤1.2和PFA溶液到合适的液体废物容器的处理。如果需要的话，他们准备荧光显微镜之前在4℃下储存在PBS中的细胞外基质的样品。 2.一个ECM蛋白沉积跟踪由活细胞的共聚焦显微镜成像计数血球下细胞。对于COS-7细胞，板250,000细胞上转染60毫米的细胞培养皿。 注：对于活细胞成像，细胞必须与编码感兴趣的ECM蛋白，在框内融合与遗传编码发出荧光的载体转染的NT标记。这是为了使所关注的细胞外基质蛋白的过程中活细胞成像的鉴定。 后的适当时间用于蛋白质表达（ 例如，16小时），从用胰蛋白酶-EDTA溶液皿除去细胞，用血细胞计数器计数它们，并且板〜150,000个细胞到用于成像的35毫米网格，玻璃底皿。允许对电池2小时，以重新连接，并开始ECM沉积（的时间段将取决于细胞类型和必须凭经验建立）。 注意：使用不含有酚红，因为这可以得到红色色调影响图像质量的细胞培养基。 在上述2小时内，设立了共聚焦显微镜用37℃培养箱室和CO 2的供应。允许在腔室和在盘的温度稳定至成像之前37℃;这可能需要1小时。 孵育镀到网格碟30分钟的荧光细胞标记35毫米的细胞。然后，洗涤​​细胞在成像之前无酚红培养基中两次。 注：细胞质的荧光标记物可以用于可视化细胞卷或膜掺入标记物可以用于可视化小区边缘。 使用20X物镜和相衬的共聚焦显微镜，标识包含了一些（> 3）贴的，健康的细胞适当的方格。确认所选择的靶蛋白在使用63X或100X的目标和在荧光显微镜下的相应波长的选择的网格内的细胞中的表达。 使用Z-栈软件设置荧光和相衬时间推移成像。将“开始”堆栈仅仅是个ECM层和“结束”堆栈下面是公正细胞体的上方。取决于细胞类型设置的z步长到0.3微米，在z体积为5和10微米之间的深度在总。这将每个时间点15-30 Z-部分之间给。 Capturë荧光（红色荧光蛋白（RFP），激发= 555 nm，发射= 584纳米）和相位对比图像周期性超过设定的时间段。例如，使用时间推移软件设置在2分钟的时间间隔，持续时间为2小时。选择“开始”按钮在定义的时间段，开始z轴部的图像的捕获。 在时间周期结束时，从盘除去细胞，如在步骤1.1-1.5中所述，以确认在ECM感兴趣的荧光标记蛋白的定位。 使用相衬成像和20X客观搬迁相关的方格。 切换到63X物镜和荧光显微镜下识别的ECM层。这一形象比较提取前映像 3.细胞来源的ECM的无菌制剂的细胞功能测定盖玻片上，另一珀普生长细胞的一个群体（“黑客帝国生产者”细胞）特征研在至少24小时100毫米细胞培养皿（“测试”细胞）在标准培养。 注意：这些可以是任何两个不同的贴壁细胞类型，实验设计可以包括一种或两种细胞群的转染以表达荧光标记的ECM蛋白。 在层流罩，作为用于细胞培养，制备PBS中的无菌溶液不含Ca 2+ / Mg 2+离子 ，20mM的氢氧化铵通过使每通过无菌0.2（参见步骤1.3），和去离子H 2ö微米的过滤器到一个合适的无菌容器中。 保持无菌技术，轻轻三次用无菌PBS（见步骤1.2）洗盖玻片上的“矩阵制片人”的细胞。 通过抽吸用无菌移液管除去PBS中并在合适的液体废物容器处理它。添加20毫摩尔氢氧无菌铵（3毫升/ 100mm皿）中，用在间隔摇动孵育他们5分钟。 添加丰富的金额无菌去离子H型2 O的“矩阵生产者”菜，每100mm培养皿至少20毫升，用摇摆，并倒掉细胞裂解物到合适的废物容器中。 重复步骤3.5四次，以确保完全除去氢氧化铵溶解的材料制成。 注：盖玻片存放于“矩阵生产者”细胞ECM然后提供与任何感兴趣的测试细胞功能检测无菌ECM。 孵育从细胞库存培养皿试验细胞用1.5毫升的每100mm培养皿胰蛋白酶-EDTA溶液（0.05％w / v的胰蛋白酶和0.02％w / v的EDTA中Hank氏平衡盐溶液），直到测试细胞从培养皿分离的。添加细胞培养基，在400 XG 5分钟离心试验细胞，除去上层液体。 重悬测试细胞在新鲜，无菌的培养基并用血细胞计数器计数。板，这些测试单元的适当数量到上coversli无菌的，孤立的ECMPS。培养他们在适当的细胞培养基中进行2-3小时，或用于为实验设计所需的时间周期。 为了检查细胞骨架的组织，固定在测试细胞中的2％的PFA和异硫氰酸荧光素染色它们（FITC）-phalloidin（激发= 490 nm，发射= 525纳米）来可视化F-肌动蛋白并用4'，6 -diamidino基-2-苯基吲哚（DAPI;激发= 358 nm，发射= 461纳米）以可视化的核11。 注：比较在铺于异源细胞来源的ECM与镀上自己的ECM测试细胞的试验细胞的形态和肌动蛋白的组织。 4.分离的ECM的用于SDS-PAGE，免疫印迹分析，或蛋白质组学成长100 MM细胞培养皿（5至10道菜蛋白质组学或1-2菜肴免疫）利息贴壁细胞24-96小时，为适合的细胞类型，允许分泌和ECM沉积。 除去细胞作为DESCRIBED步骤1.1-1.5。 倾斜每块板以一定的角度2 O排出残留轰到培养皿底部，并小心地取出任何剩余的H 2 O运用P200的吸管，直到板完全干燥。 平行地，含热的SDS-PAGE样品缓冲液的100mM二硫苏糖醇（DTT）至95℃使用热块2分钟，然后将其添加到板。每100mm板样品缓冲液200微升适合于通过免疫印迹进行检测的样本。 分析通过质谱法的ECM，由从盘收集的SDS-PAGE样品缓冲液（如在步骤4.5和4.6，如下所述）实现更浓缩的样品，将其重新加热至95℃，并在使用相同的等分试样额外的2-3片。 使用细胞刮彻底刮除ECM关闭的菜，确保菜的所有区域都被擦。 用细胞刮刀，收集样品到培养皿的一侧，并用200移除μL枪头，成筒。 传送从细胞刮刀尖端的任何残余的SDS-PAGE样品缓冲液提取到管以减少的ECM材料的损失。对于浓缩的样品，再热同的SDS-PAGE样品缓冲液等分试样到95℃，并在整个额外2-3板重新使用它。 解决通过SDS-PAGE 12，即使用7％或4-7％的梯度聚丙烯酰胺凝胶中的ECM蛋白。 注意：为方便起见，使用预先染色的蛋白标记。 为了增加高分子量ECM蛋白的分辨率，延长凝胶运行时间，使得37 kDa的分子量标记运行接近凝胶和分子量标记物<37 kDa的底部已跑出凝胶。 用于ECM蛋白的蛋白质组分析，染色用蛋白质染色的凝胶和捕获图像。切感兴趣频带从凝胶中，用胰蛋白酶消化它们，并通过基质辅助激光解吸分析它们/电离（MALDI）-mass光谱<SUP> 13。 可替代地，用于对ECM提取物的更全面的分析，并分析整个样本，切片凝胶泳道段，消化它们与胰蛋白酶，以及执行液相色谱-质谱（LC-MS）14。 可替代地，对于免疫印迹15，在15 V转移从SDS-PAGE凝胶的蛋白质到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜至少1小时10分钟（半干法），以确保高分子量ECM蛋白的转移。可视转印到膜上用丽春红硫染色的总蛋白。 以下步骤4.11中，使用抗体来建立的存在和/或使个别ECM蛋白15的半定量分析。 该膜用2％在TBS-吐温20（封闭缓冲液）（重量/体积）奶粉在4℃下过夜阻塞。稀释至ECM蛋白的特异性抗体在封闭缓冲液中并在室温下与膜孵育1.5小时（抗体对fibronectin稀释1/600和抗体血小板-1稀释1/150; 补充表1）。 通过重新探测相同的印迹与抗体丰富细胞内蛋白质，如肌动蛋白或微管蛋白（抗肌动蛋白稀释1 / 10,000和抗微管蛋白稀释1/5000）测试的ECM隔离的质量。