JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Визуализации Металлы в ткани головного мозга методом лазерной абляции - индуктивно связанной плазмы - масс-спектрометрии (LA-ICP-MS)

Published: January 22, 2017
doi:
10.3791/55042
, , , , , , , , , ,
1Elemental Bio-imaging Facility,University of Technology Sydney, 2Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,The University of Melbourne, 3Department of Pathology,The University of Melbourne, 4School of Earth Sciences,The University of Melbourne, 5Research School,Ruhr University, 6Department of Physiology,Monash University, 7ESI Ltd., Bozeman, 8Agilent Technologies, Mulgrave

Summary

Количественно отображение металлов в ткани методом лазерной абляции – с индуктивно связанной плазмой – масс-спектрометрии (LA-ICP-MS) является чувствительным аналитический метод, который может обеспечить новое понимание того, как металлы участвуют в нормальной функции и болезни процессов. Здесь мы опишем протокол для количественной визуализации металлов в тонких срезов мышиного неврологического ткани.

Abstract

Металлы встречаются повсеместно по всему организму, с их биологической роли диктуемого как их химической реакционной способности и обилию в пределах определенной анатомической области. В головном мозге, металлы имеют весьма разобщенным распределение, в зависимости от основной функции, которую они играют в центральной нервной системе. Визуализация пространственного распределения металлов обеспечило уникальное понимание биохимического архитектуры головного мозга, что позволяет прямую корреляцию между нейроанатомической регионов и их известной функции в отношении металлических нестационарных процессов. Кроме того, несколько возрастных неврологических расстройств Функция нарушается гомеостаз металла, который часто ограничивается мелкими областями мозга, которые в противном случае трудно анализировать. Здесь мы опишем комплексный метод количественного визуализации металлов в мозге мыши, с помощью лазерной абляции – с индуктивно связанной плазмой – масс-спектрометрии (LA-ICP-MS) и обработку специально разработанные изображенияпрограммного обеспечения. Сосредоточение внимания на железо, медь и цинк, которые являются три из наиболее распространенных и болезненных релевантных металлов в головном мозге, мы опишем основные этапы подготовки проб, анализа, количественных измерений и обработки изображения для получения карт распределения металла в низкой микрометра диапазон разрешения. Этот метод, применим к любой секции разрез ткани, способна демонстрировать сильно изменяющимися распределение металлов в органе или системе, и могут быть использованы для выявления изменений в металлическом гомеостаза и абсолютные уровни в пределах тонких анатомических структур.

Introduction

Уникальный окислительно-восстановительной химии металлов способствует целый ряд неврологических функций, включая передачу сигнала, производства энергии и синтеза нейромедиаторов. В ряде крупных нейродегенеративных заболеваний, dyshomeostasis из этих металлов были и замешаны в патогенезе заболевания и идентифицированы как потенциальные мишени новых для терапевтического вмешательства 1. Для того, чтобы лучше понять, как металлы участвуют в таких условиях, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона (AD и PD, соответственно), крайне важно, чтобы иметь возможность измерить как распределение металла и уровни изменяться в регионах, пострадавших от процесса заболевания. Эти изменения часто указывают на тонкие изменения в биохимических реакций , которые могут быть тесно связаны с процессами , которые инициируют гибель клеток, таких , как недавно предложенного нами механизма железа и дофамина нейротоксичности в PD 2.

Традиционно, метаУровни л в пределах определенных анатомических областей было достигнуто за счет тщательного иссечения, пищеварения и анализа с использованием целого ряда аналитических методов 3. Тем не менее, такой подход теряет пространственную информацию, которая может иметь решающее значение при болезненных состояниях расследуются связаны с небольшими, четко определенных регионов или конкретных типов клеток. Ряд аналитических методов доступны для визуализации металлов в биологических системах, от неповрежденных образцов до срезов тканей , так и в двух и трех измерениях, используя эмиссионной спектроскопии, флуоресцентных зондов и масс – спектрометрии 4. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки в отношении чувствительности, селективности химических частиц, и пространственное разрешение, которое может быть достигнуто. Для полного обзора ассортимента доступных методов, см обзор по Hare и соавт. 5.

Масс-спектрометрия (МС) основе методы являются наиболее чувствительными из этих методов, Способный измерять наиболее биологически соответствующих металлов при их концентрации нативного 6. Лазерная абляция – с индуктивно связанной плазмой – масс-спектрометрии (LA-ICP-MS) формирования изображения используется сфокусированный ультрафиолетовый лазерный луч размером от 1 до> 100 мкм в диаметре (или ширины, когда используется четырехугольная форма пучка), в соответствии с которым проба проходит 7. Количественная информация может быть достигнуто за счет репрезентативной абляции стандартных справочных материалов, которые могут быть получены с использованием различных подходов , различающихся 8, каждый с разной степенью технической сложности и аналитической практичности. Наиболее общий подход использует матрицу-соответствия, где стандартная с преимущественным химического состава сравнима с таковой образца получают путем пики с целевым анализируемым веществом и точно оценены по однородности и абсолютной концентрации металлов с помощью независимых аналитических средств 9, </suр> 10. Абляция подготовленных стандартов может затем использоваться для внешних целей калибровки, что позволяет концентрации данных из полученного изображения образца быть извлечены на пиксель.

Разрешение изображения определяется как размер пучка и скорости, при которой образец сканируют. Стандартный квадрупольного дизайн ICP-MS ( на долю которых приходится более 90% всех установленных систем ICP-MS по всему миру 11) представляет собой последовательный масс – анализатор, в том , что циклы детектора массы через всех выбранных отношения массы к заряду (м / г ), а не сбор данных одновременно. Таким образом, время сбора для каждого цикла масс должны приравнять ко времени , затраченному для образца , чтобы пройти через одну ширину лазерного луча , чтобы обеспечить пиксель представитель требуемого разрешения приобретается 12. Лазерный луч выбора размера является важным параметром, который оказывает значительное влияние на чувствительность как и общее время анализа. Как лазерной абляции physiчески удаляет материал, который заметен на ИСП-МС с помощью газа-носителя аргон, количество вещества, которое может быть физически обнаружены масс-анализатора следует закону обратных квадратов. Например, уменьшение диаметра лазерного луча от 50 – 25 мкм приводит к снижению абляцированную материала в четыре раза. Кроме того, в качестве способа сканирования, меньшие диаметры пучков увеличивают общее время, необходимое для абляции выбранной области. Таким образом, экспериментальная конструкция имеет важное значение, чтобы сбалансировать необходимое пространственное разрешение с потребностями чувствительности и временных ограничений.

Обработки изображений с помощью LA-ICP-MS была применена к ряду образцов, матриц и болезненных состояний, в том числе на животных моделях неврологических расстройств 13, 14, черепно – мозговая травма 15, распределение содержащего металл противораковые препараты 16, токсикантов воздействия в плаценте 17 и металла Распределителиibution в зубах, как биомаркера ранней жизни диетических переходов. 18 В этом протоколе мы опишем общий метод получения изображения железа, меди и цинка в головном мозге мышей WT при разрешении 30 мкм, хотя она может быть легко адаптирована к различным типам образцов и экспериментальных результатов, основываясь на нуждах аналитик.

Protocol

Процедуры, описанные выше, были одобрены Комитетом по Флори животных по этике и придерживаться стандартов Национального исследовательского совета по здравоохранению и медицинским ухода за животными. 1. Подготовка пробы для анализа Примечание: Этот шаг зависит от матрицы анализируемого образца. Подготовка проб и секционирования Примечание: Фиксирование с использованием 4% параформальдегида (PFA) и криозащиты в 30% сахарозы в 0,1 М PBS, будет приводить к различным количеством выщелачивании металлов из ткани. См Hare и соавт 19 для конкретных деталей. Убедитесь, что все образцы прошли идентичные фиксации и криозащиты шаги. Транскардиальную заливать эвтаназии животное с ледяной 0,1 М PBS, рН 7,4 (см раздел методов в Dodt и др. 20 для получения информации) и извлечь мозг. Поместите мозг в 4% PFA O / N, чтобы зафиксировать ткань. <li> Cryoprotect мозг, поместив его в 30% сахарозы в 0,1 М PBS в течение 24 ч, а затем изменить на свежий 30% сахарозы в течение еще 24 ч. 19 Замораживание мозг в криостате при -20 ° С в течение не менее 1 ч. Установите мозг на патроне с помощью подходящего монтажного среды. Раздел мозг на криостат с использованием безметаллический одноразового лезвия (например, политетрафторэтилена [PTFE] -покрытие ножи) и смонтировать на стандартном предметном стекле микроскопа. Оптимальная толщина для секции должна составлять приблизительно 30 мкм. При использовании залитых парафином образцов, раздел в нужной толщины, поплавок ленту на ванну с теплой водой и смонтировать на стандартные предметные стекла микроскопа. Примечание: Точные эффекты долгосрочной фиксации и парафином вложения биологических образцов не известны. Как описано в разделе 1.1, убедитесь, что все образцы прошли идентичные процедуры подготовки образца, если сравнительный анализ предназначен. депарафинизации годовыхRaffin встраиваемый образцы путем погружения слайда в 3 смены ксилола, 1 смена каждого из: 100% этанола, 95% этанола, 70% этанола и минимум 3 изменений в ISO 3696 или эквивалентной очищенной воды (далее именуемые " вода '; см Hare и соавт 21 для детального метода).. Разрешить образцы высохнуть на воздухе в течение приблизительно 1 ч в среде без пыли, таких как бокс слайдов с образцами, размещенных вертикально в стойках и крышке левой приоткрыта. 2. Получение матричных соответствием стандартам Примечание: Ниже приводится краткое протокол ранее опубликована 9. Пожалуйста, обратитесь к оригинальный документ для детальных шагов по подготовке стандартов ткани матрицы соответствием. Получить коммерческие мозги ягненка (или аналогичный) и промыть в воде, удаляя всю кровь и соединительную ткань. Используя скальпель, тщательно препарировать примерно 50 г коры головного мозга Tissuе и частично гомогенизируют с помощью ручного гомогенизатора ткани с поликарбонатной одноразового зонда на малой мощности. Разделить на 5 г аликвоты, с номером в зависимости от диапазона калибровки и число точек калибровки желательно. Подготовка растворов металлов к спайку каждого стандарта путем растворения растворимой соли каждого анализируемого вещества (например, FeSO 4 · H 2 O) в 1% азотной кислоты с получением 0,1, 1 и 100 мг металла мл -1 запасов. Добавление предварительно рассчитанным объем исходного раствора в 5 г на аликвоты ткани (например, 5 мкл 10 мг мл -1 для приблизительного конечной концентрации 10 мкг г -1 сырой ткани) для достижения диапазона колосовых уровней атомов металла в каждый стандарт. В зависимости от требуемой конечной концентрации каждого стандарта, используют комбинацию каждого металла маточного раствора, чтобы обеспечить минимальное количество решений добавляются к стандарту. Добавить последний всплеск воды для каждого стандарта, чтобы гарантировать, следуОбъемы валентных добавленной жидкости присутствует в каждом стандарте. Перемешать зубчатым стандарты на малой мощности в течение примерно 30 секунд. Если не будет использоваться сразу, хранить замороженными при -20 ° С в полипропиленовые пробирки крышками запечатанных парафильмом. Определить точную концентрацию и однородность каждого стандарта с использованием любого из следующих способов: Микроволновая печь пищеварения Поместите 6 точно взвешивают (примерно 50 мг) аликвоты стандарта в вымытые PTFE сбраживания сосуд и добавляют 4 мл концентрированной (65%) азотной кислоты и 1 мл 30% -ной перекиси водорода. Уплотнение и переваривать при 500 Вт в течение 30 мин. После охлаждения переваривания сосуд, открытый в вытяжном шкафу и количественно перенести переваренной решение кислотосвязывающего промывали 50 мл пробирку с использованием 10 мл аликвотами воды. Сделать приблизительно до 50 мл, и точно взвешивают массу конечного раствора. Повторите шаги 2.5.1.1 – 2.5.1.2 для каждого стандарта. Используйте следующую процедуру, если микроволновое переваривание оборудование не доступно: Поместите шесть точно измерить (между 25 – 200 мг) аликвоты стандарта в кислотно-промытый / безметального полипропиленовую трубку и лиофилизации O / N. Добавьте 40 мкл концентрированной азотной кислоты и тепла, раскрытый, на нагревательном блоке до 70 ° С в течение 5 мин, а затем добавляют 10 мкл 30% перекиси водорода. Тепло еще в течение 5 мин, а затем аккуратно сделать до 1 мл общего объема с использованием 950 мкл 1% -ной азотной кислоты. Примечание: Желательно, чтобы переварить сертифицированный справочный материал с использованием метода выбора для обеспечения процедуры пищеварения являются точными. Определить концентрацию металла в каждом растворе дайджеста по распыляемого раствора ИСП-МС с использованием стандартного протокола. Оценка однородности каждого стандарта путем определения относительного стандартного отклонения (RSD%) между каждой аликвоты. Обеспечить% RSDS все падение в пределах 15%. Используя измеренную массу еач аликвоту, вычислить точную концентрацию металла каждого стандарта гомогенизированной ткани. Возвращаясь к стандарту гомогенизированной ткани, пакет 5 х 5 мм пластиковые одноразовые гистологии форму и замораживать в изо -пентана охлаждают в жидком азоте. Удалить Замороженную стандартный блок ткани из формы и секции на криостате при той же толщины, что и образец. Примечание: Рекомендуется подготовить количество секций при различной толщины для будущих экспериментов. Air высушенных стандарты могут храниться бесконечно в герметичном контейнере и пыли. 3. Подготовка LA-ICP-MS для анализа Место стандарты и образцы в абляции камере, гарантируя, что они находятся в пределах глубины резкости ПЗС-камеры, установленной на устройстве LA. Если настройка прибора необходимо, включать соответствующий справочный материал (например, NIST 612 микроэлементами в стекле). Закрутите два винта на двери камеры, чтобы запечатать йэлектронной абляции камеры. В программе ICP-MS, выберите открытый газовый клапан аргона в «Техническое обслуживание» или аналогичной панели и установите поток газа – носителя до 1,2 л мин -1 в соответствующем диалоговом окне. Примечание: В данном протоколе используется аргон в качестве газа-носителя. Несколько примеров используют гелий или смесь гелия и аргона в качестве газа-носителя. См Гюнтер и Генрих 22 для технических деталей для использования гелия и аргона смесей в качестве аэрозольного газа – носителя. В программном обеспечении LA, нажмите на кнопку «очистить», чтобы промыть клетки с аргоном в течение как минимум 30 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Время продувки может быть изменен, нажав «очистить время» или аналогичную кнопку. При использовании системы абляции с абляции клетки двухтомнике, периодически перемещать сцену в каждом углу и по диагонали пересекают клетку, чтобы обеспечить столько, остаточный воздух удаляется из клетки, как это возможно. Это может быть достигнуто путем выбора «дома» или этапы эквивлентным функция. Включите ICP-MS, нажав 'плазмы на' и позволяют разогреть в течение двух часов, в течение которых ступает 3.5 – 4.4 можно проводить. Установки прибора варьируются от разных производителей, хотя пример соответствующих условий эксплуатации ЛА-ИСП-МС можно найти в Hare и соавт. 10. Представитель абляция стандартов тканей Выберите инструмент линии и нарисуйте одну строку абляции приблизительно 3 мм длиной по всей поверхности ткани. Установите параметры следующим образом, щелкнув правой кнопкой мыши на строку абляции в списке экспериментов и изменения следующие: диаметр луча (выбранный в зависимости от обстоятельств пользователем; квадратный пучок 30 мкм используется здесь), скорость сканирования (в 4 раза диаметр луча в секунду; 120 мкм с -1) и плотности потока энергии (0,3 -0,5 J см -2 для мягких тканей; оптимизировать при необходимости для более твердых матриц). При толщине 30 мкм ткани лазерный луч не проникает в полной thickness этой ткани, устраняя любые потенциальные загр знени из поддержки микроскопа. Нормализация к углероду 23 может быть использован для коррекции изменения в объеме ткани абляции. Установите эти параметры по умолчанию для каждой последующей строки, нажав кнопку "По умолчанию" радио. Дубликат этой линии шесть раз, выбрав начальную строку, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав пункт "Дублировать сканирование". Убедитесь , что линии смещены либо Х – или y- оси диаметра пучка. Это дает в общей сложности семь линий в соответствии со стандартом, разнесенных в зависимости от диаметра пучка. Повторите шаги 3.5.1 – 3.5.3 для каждого стандарта, обеспечивая линии одинаковой длины. Чтобы нарисовать область абляции по образцу, по одной из двух следующих способов: Примечание: Убедитесь, что одни и те же параметры сканирования (диаметр луча, скорость сканирования, плотности энергии) используются для выборки строк. Если система LA оснащенаширокого поля зрения, выберите инструмент линии и нарисуйте линию от верхнего левого угла образца достаточно долго, чтобы покрыть образец в самом широком месте, используя те же параметры лазера, описанные в 3.5. Дублирование это сканирование, как описано в разделе 3.5.3 с линиями, разнесенных в зависимости от диаметра луча столько раз, сколько необходимо для обеспечения полного охвата образца. Если широкое поле обзора не доступна, определить и записать координаты х и у ( как правило , отображается на главном экране , как «положение ступени» или аналогичный) , соответствующие углам прямоугольника , охватывающего весь образец. Используйте эти координаты для позиционирования параллельных линий абляции, охватывающих всю область образца, как описано в 3.7.1. Рисовать линии для периодического сканирования стандартов самое позднее после ~ 20 ч сканирования образца, повторяя процесс, описанный в 3.5. В зависимости от длительности сканирования образца этого может потребоваться несколько раз. Завершение эксперимента с дополниного сканирования стандартов. Примечание: При определении координаты х и у , а ячейка очищается, выбирая исходное положение и связанное с ним калибровка оси изменит ранее приобрела специфические для координаты х и у , тогда разность (т.е. длина линии) будет не затрагивается. 4. Настройка данных методов сбора для ИСП-МС Для стандартной линии абляции, разделите длину линии от скорости лазерного сканирования, чтобы определить общее время анализа для одной линии. Повторите эту процедуру для образца линии. В программном обеспечении ICP-MS, создать новый метод (показанный здесь как "партии") и убедитесь, что "время разрешен анализ" или выбран эквивалент. Выберите значения m / z, чтобы обнаружить, а затем настроить время интегрирования для каждого т / г, так что общее время интегрирования для одного цикла составляет 0,25 с. Нажмите кнопку "Сохранить Batч Как 'и имя соответственно (например, STD1). Примечание: По мере того как образец будет проходить лазерный луч в четыре раза больше диаметра пучка, что обеспечивает точка данных для каждой массы записывается эквивалентно диаметру пучка 12. Например, используя размер 100 мкм пятно, скорость сканирования 400 мкм с -1 со временем интегрирования 0,25 сек будет производить изображения с истинными размерами пикселей. Время интегрирования может быть отрегулирован для повышения чувствительности; при увеличении времени интегрирования скорости сканирования 0,33 сек должно быть замедлено в три раза диаметра пучка. Для стандартов, введите время анализа для каждой линии сканирования в соответствующем поле, плюс дополнительные 15 секунд для учета лазерного прогрева и время размыва. Введите пример списка Запуск (т.е. порядок , в котором запускаются сканирование) с таким же числом приобретений (обычно нумеруются последовательно, то есть 001, 002 и т.д.), от общего количества стандартных линий. Для получения образца, Дублировать метод, используемый для стандартов, сохранив текущий метод или партии с альтернативным именем файла, а также настроить общее время приобретения (в том числе дополнительных 15 с) и общее количество приобретений, чтобы соответствовать количеству линий, которые будут абляции образца , Примечание: В большинстве систем LA-ICP-MS используют односторонний триггер (LA запускающее ICP-MS), важно, чтобы программное обеспечение ИСП-МС ожидает спусковой крючок от Лос-Анджелеса до последующей линии абляция начинается. Окно Приобретение ICP-MS прочтет "ждет старта". 5. Запуск эксперимента Запуск очереди ICP-MS путем добавления первого метода или пакета в очереди и обеспечить программное обеспечение ожидает спусковой механизм из системы ЛА. В программном обеспечении LA, включите лазерный источник питания, нажав кнопку "выбросов", нажмите кнопку "Выполнить" и установить время лазерного прогрева до 10 сек и вымывания время до 20 с в соответствующих полях. Примечание: Это будет перерасходобеспечить ICP-MS готова начать получение новых данных, когда лазер начинает каждую последующую линию абляции. Начало лазерной последовательности, нажав кнопку «Пуск». При использовании двухтомный клетки, обеспечить образец чашки находится в положении. 6. Расчет Количественное определение стандартов Примечание: Есть несколько вариантов для преобразования данных ICP-MS в образы. Они включают в себя использование самодельных программных средств , написанных на языках с открытым исходным кодом 17, 24, 25, 26 коммерческих макросов и данных программного обеспечения для анализа. 7 Здесь, использовать недавно разработанный программный модуль ( как описано в Paul и др. 27), основанный на специализированном LA-ICP-MS анализа данных набора 28. Перенесите все папки , содержащие пакетные данные Run (001.d, 002.d и др.) На котдельный компьютер с программным обеспечением для анализа установлено. Извлечение файлов данных * .csv для каждой линии партии в отдельную папку. Примечание: Использование сценария для автоматической передачи файлов * .csv в новую папку, настоятельно рекомендуется. Смотрите приложенный код Python для более подробной информации. Этот сценарий был написан в соответствии с либо Agilent 7700 или 8800 Series ICP-MS, но могут быть изменены в соответствии с выходной файл от других производителей. Откройте программную платформу и следуйте Вкладки последовательно импортировать и анализировать стандарты для получения количественных изображений, как описано ниже. Чтобы импортировать данные из первого стандартного пакета, выберите 'Agilent .csv' для 'Тип файла', 'всю папку' для 'типа Import' и убедитесь, что 'Формат даты' совпадает с форматом компьютера. Нажмите кнопку "Импорт", выберите папку, содержащую .csv-файлы для первого набора стандартов, и перейти на вкладку "Исходные данные". базовая линиявычитание Используйте вкладку "Автоматическая опциям пункта (команда 2) из ​​главного меню приложения выпадающего на панели инструментов, выберите« Информация от импорта "и нажмите кнопку" Продолжить ". Нажмите кнопку "Выбрать все" и выберите "Baseline_1" для интеграции. Для того, чтобы выбрать первые 10 секунд каждой строки развертки (соответствующего лазерного времени прогрева), обрезать данные путем ввода второго значения '0' и '(продолжительность линии – 10 сек) "и нажмите кнопку" Добавить интеграций "(например , , для линии сканирования 35 сек, введите значения '0' и '25'). Чтобы выбрать образец данных, используйте вкладку "Автоматическая опциям пункта, как описано в 6.4, но выбрать 'OUTPUT_1', как интеграция. Crop данные с начала и конца каждой стандартной линии , чтобы исключить фоновый сигнал (например , для линии сканирования 35 сек, введите значения '13' и '4'). Чтобы исключить капли в сигнале, вызванного возмождаемых отверстия в стандартах, на вкладке "Samples", нажмите кнопку "каналы" в верхнем левом углу области графика , чтобы выбрать канал с высоким отношением сигнал-шум (например, С13 или Р31). Запишите каких-либо резких перепадов сигнала и выберите значение CPS на достаточно низком уровне, что находится ниже нормальной вариации в образцах, но достаточно высоко, чтобы выбрать самые резкие перепады в сигнале. Перейдите на вкладку "DRS 'и выберите' Baseline_Subtract 'для' схемы редукции данных Current '. Выберите канал из 6.6 для 'Index Channel' и значение CPS для "Порог для использования при низких маскирующие сигналы. Вставьте значение <0,5 с для 'секунд, чтобы обрезать до / после низких сигналов "для учета задержки в передаче сигнала от лазера к ИСП-МС. Для того, чтобы подтвердить адекватную маскирование районах с низким уровнем сигнала, нажмите кнопку Назад на вкладку "Samples" и выберите след канала обрабатываются (например., Fe56_CPS). Повторите результаты КПА и & #39; секунды, чтобы обрезать до / после значений сигналов низкого ', как в 6.7, если это необходимо. Перейдите на вкладку "Результаты" и выберите "Экспорт данных" из главного меню приложения в раскрывающемся меню. Введите имя файла для создания файла таблицы данных результатов (например, расчеты STD1, Std2 …). Откройте файл данных в подходящей программе электронных таблиц и вычислить значения CPS для каждого отдельного канала будет количественному. С помощью заранее заданных концентраций металлов из раствора ингаляторы ICP-MS для расчета коэффициента преобразования из значений СУЗ в ppm (мкг г -1) для каждого количественному элемента. Повторите шаги 6.3 – 6.10 для всех наборов стандартов в перспективе. 7. Построение количественных изображений Написать 'биотит ()' в командной строке, чтобы открыть программное обеспечение. Импорт образец данных, нажав "Load Images" и выберите папку, содержащую файлы .csv-FOг изображение образца. коррекция фона Перейдите на вкладку "Исходные данные", чтобы применить коррекцию фона для образца. На фосфора (Р31) изображение будет предложено на экране, выберите участки фона с помощью инструмента прямоугольник дро. Выбор, как многие регионы, как это возможно создает изображение в масштабе карта сигнала дрейфа / плазмы, чтобы обеспечить адекватную компенсацию от этих искажающих факторов. Для того, чтобы фоновый сигнал более видимым, выберите инструмент редактирования графа (вверху слева от отображаемого изображения) и щелкните правой кнопкой мыши на изображение. Выберите "Изменить внешний вид изображения" и изменить 'Первый цвет при Z =' к большим отрицательным значением (например , -100,000). Продолжайте, нажав кнопку "Готово". Перейдите на вкладку "стандарты", чтобы открыть таблицу для коэффициентов коррекции CPS / частей на миллион. Введите значения, вычисленные по стандартам на этапе 6.10 для каждого из элементов. Этот шаг поможет исправить дрейфа чувствительности в ИСП-МС. Нажмите кнопку "Go! ' Открыть "Браузер данных" на вкладке "Data ', который содержит изображения для каждого элемента и каждого шага. Для того, чтобы завершить изображение для экспорта, выберите нужное изображение в папке "StdCorrImages", щелкните правой кнопкой мыши имя изображения (* _ppm) и нажмите кнопку 'NewImage'. Щелкните правой кнопкой мыши на изображение, чтобы открыть "Изменить внешний вид изображения", чтобы выбрать нужный цвет таблицы и цветовую гамму. Добавить цветовую шкалу к изображению, щелкнув правой кнопкой мыши на изображение и выберите "Добавить аннотацию". Выберите 'ColorScale' из верхнего левого выпадающего меню и использовать вкладки для изменения желаемого цвета шкалы. Для того, чтобы экспортировать изображение, убедитесь, что изображение в вопросе выбора и перейдите на вкладку "Файл" и нажмите "Сохранить графику … '. Выберите нужный формат и сохранить изображение. В качестве альтернативы, выбранное изображение может быть передан с помощью функции копирования и вставки инструментов. Повторите шаги 7.6 и 7.7 для всех изображений, представляющих интерес. Quantifлнение дискретных областей Для активации ROI инструментов, перейдите к 'Analysis' вкладке "Пакеты" и выберите "Обработка изображений". Выберите нужное изображение и перейдите на вкладку "Изображение" и выберите "ROI … '. Нажмите кнопку "Пуск" ROI рисовать и использовать инструмент для рисования, чтобы выбрать интересующую область в образце. Чтобы закончить рисунок, нажмите кнопку "Готово" ROI. Для того, чтобы получить статистику для выбранной ROI, перейдите на вкладку "Изображение" и нажмите кнопку "Статистика …". Скопируйте и вставьте результаты в отдельной таблице. Повторите выбор ROI (7.9.2) для всех регионов и элементов, представляющих интерес.

Representative Results

Для демонстрации возможностей такого подхода визуализации LA-ICP-MS, простой эксперимент с использованием одного сечение / 6 мозга мыши WT C57BL, на пополам мозолистого тела и секционного в корональной плоскости, представлена. Последовательность действий для анализа данных с использованием биотит (Рисунок 1), как описано в разделах 6 и 7, а также для обеспечения представительного изображения распределения металла в секции анализируемой (рисунок 2) также описано. Как можно видеть, распределение металла в головном мозге мыши изменяется в зависимости от анатомической области. Это может быть связано с переменной ролями металлов, и более конкретно белки , к которым они присоединены, играть в каждом регионе мозга 27. Например, железо имеет тенденцию иметь более высокие концентрации в мозге и вдоль зубчатую извилину, в то время как цинк наиболее обильна в Кортиевческие районы. Углерод, который обычно используется внутренний стандарт 8, гомогенно распределены. Элементарные карты (рисунок 2) , может быть особенно полезным при использовании в сочетании с существующими анатомическими и функциональными ссылочных атласам 29, где информация о колокализации металлов может экспрессия специфических металлов-связывающих белков могут дать представление функции металлов в головном мозге региона или изменения уровня металла в соответствии с выявленной болезни, связанные с биомолекулы. Используя подход, описанный, который оптимизирован для более широкого спектра анализируемых веществ, не исключает чувствительности к низким элементов численности, таких как марганец, и методы могут быть приспособлены, чтобы сосредоточиться в первую очередь на этом аналита путем увеличения времени обитать за счет других измеренных масс. Основное преимущество при использовании изображений с помощью LA-ICP-MS наблюдает относительные различия в металлических Концвания и распределения между экспериментальными группами. Ранее мы уже использовали такую технику , чтобы продемонстрировать повышенное железо следующее нейротоксин оскорбление , имитирующей PD 2, 10, а также изменения в корковых уровней железа в ткани 21 заболевание человека Альцгеймера. Такой протокол, как описано здесь, может быть легко адаптирована к любому другому типу ткани с минимальным поправками к перечисленным методам. Рисунок 1: Последовательность действий при обработке изображений. Рабочий процесс комплементарной секций 6 и 7, изображающих превращение сырого времени решенных данных от ICP-MS для количественного изображений распределения металла в мозге мыши. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. </p> Рисунок 2: Типичная Elemental Распределение биометаллами в головном мозге мышей. Представительные карты элементом 30 мкм толщиной корональной части одного полушария мозга мыши анализировали с использованием LA-ICP-MS. Изображения для углерода-13 (C13), магний-24 (Mg24) и фосфора-31 (P31) отображается в золотой цвет шкал (число импульсов в секунду, ХП) (верхний ряд). Количественные изображения (нижний ряд) для марганцево-55 (Мп55), медь-63 (Си63), железо-56 (Fe56) и цинк-66 (Zn66) отображаются с соответствующими цветовыми шкалами BlueHot (мкг г -1). Общее время анализа для участка мозга был приблизительно 5 ч. Шкала бар = 2 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <strong> Дополнительный код файла 1. Открытый исходный код Python , описанный в пункте 6.1, который может быть изменен с помощью соответствующего редактора Python в соответствии с методом ICP-MS изготовителя вывода данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Визуализации металлов в неврологической ткани является лишь одним примером того, как этот протокол может предоставить полезную информацию о распределении и количестве металлов в любой биологической матрице. Несмотря на то, подготовка стандартных справочных материалов может быть трудным, это эксперимент, который может быть выполнен один раз и архивировать для последующего использования.

LA-ICP-MS имеет определенные преимущества по сравнению с альтернативными методами, такими как синхротронное на основе рентгеновской флуоресцентной микроскопии, в основном с точки зрения доступности и чувствительности. Тем не менее, есть определенные недостатки , которые следует учитывать при подготовке эксперимента с использованием LA-ICP-MS, и как таковое оно часто является полезным комплементарный метод химической обработки изображений , которая включает в себя альтернативные методы анализа металла, а также сравнительный гистохимии 5.

Согласование с известными анатомическими особенностями мозга мыши может дать полезную информацию о возможной функциональной отношений Типыonship между уровнями металла и пространственного распределения. Ранее мы использовали Allen Brain Atlas онлайн – ресурс, 29 , который является хранилищем открытого доступа обоих анатомических и генетических данных экспрессии в головном мозге мышей C57BL / 6 для изучения пространственной корреляции как экспрессии фермента металло-зависимой 14 и нейроанатомии 27, 30. Другие ресурсы, такие как верстаке Грызун мозга 31 также доступны , чтобы помочь с регистрацией и выравнивания металлических изображений , чтобы помочь в правильной идентификации распределения металла в часто мелких анатомических областях.

Применение этой методики полезны при оценке того, как металл уровней и изменение распределения на микроуровне на протяжении двух нормальных жизненных событий (например, старение) и при болезненных состояниях; а также изучение влияния обоих металлсодержащих соединений и лекарственных средств, предназначенных для целевой менятал метаболизм. В настоящее время основные ограничения LA-ICP-MS в качестве метода визуализации для оценки пространственно распределения металла являются пропускная способность и чувствительность. Существует компромисс между скоростью анализа и пространственным разрешением 5, 12, с изображениями с более высоким разрешением , требующих более длительного времени анализа. Метод хорошо подходит для биологических элементов при более высоких концентрациях, хотя элементы, такие как марганец, кобальт и селен ограничены из-за их низкой численности в нормальной ткани и / или ограничений в их обнаружения с помощью обычных ICP-MS. Новые достижения в области технологии ICP-MS, такие как введение тройного квадрупольного масс – анализаторов, позволяют целенаправленного обнаружения сложных аналитов, таких как селен 32 при высокой светочувствительности 33. В качестве процедуры технологии управляемой, достижения в области как лазер и масс-спектрометрии дизайн будет видеть эту визуализацию технику продолжают развиваться, увеличиваяскорость анализа и чувствительности 34.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DJH и PAD поддерживаются с помощью Linkage проекта Australian Research Council (LP120200081) с Agilent Technologies и ESI Ltd. Вклад BK была поддержана Рурского университета Research School PLUS, финансируемой Превосходство инициативы Германии [DFG GSC 98/3]. DJH была частично поддержана Ramaciotti фонда. KK поддерживается Juselius Фонда Сигрид.

Materials

Soda glass microscope slides n/a n/a Typical slides are suitable for all experiments
PTFE-coated microtome blades C.L. Stuckey DT315R50 Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering.
Parafomaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Any supplier suitable
Sucrose n/a n/a Commercial grade white sugar is suitable
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P5368 Pre-mixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols
Xylene Sigma-Aldrich 247624 Any supplier suitable
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Any supplier suitable
Lamb brain n/a n/a Available from most local butchers
Metal salts n/a n/a Use water soluble metal salts containing desired analytes
Omni TH Tissue Homogeniser Omni Inc THP115 Alternative homogenizers are suitable
Polycarbonate homgenizer probes Omni Inc TH115-PCRH
Microwave digestion unit n/a n/a Optional. See Section 2
1.5 mL microfuge tubes TechnoPlas P4010 Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable
65% nitric acid Merk Millipore 100441 Trace analysis grade
30% hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 95321 Trace analysis grade
10 x 10 mm disposable cryomolds Ted Pella 27181
Iso-pentane Sigma-Aldrich 76871
Liquid nitrogen n/a n/a Use local supplier
NWR213 Laser Ablation system ESI Ltd n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Agilent 8800 Series ICP-MS Agilent Technologies n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Iolite Iolite Software n/a Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol
Excel Microsoft n/a
IGOR Pro Wave Metrics n/a Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
  2. Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
  3. Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
  4. New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
  5. Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
  6. Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
  7. Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912 (2005).
  8. Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
  9. Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
  10. Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53 (2009).
  11. Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690 (2008).
  12. Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159 (2012).
  13. Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
  14. Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
  15. Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
  16. Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids – a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
  17. Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
  18. Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
  19. Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
  20. Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
  21. Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer’s disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
  22. Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
  23. Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
  24. Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
  25. Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis – An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
  26. Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
  27. Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
  28. Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508 (2011).
  29. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  30. Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
  31. Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4 (2007).
  32. Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
  33. Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma – tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements – a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
  34. Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).

Tags

Keyword Extract:Laser AblationInductively Coupled PlasmaMass SpectrometryLA-ICP-MSSpatial DistributionMetalsNeurodegenerative DiseasesICPMSLaser Ablation SoftwareBeam DiameterScan SpeedRadiant FluenceAblation AreaSample Scanning

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Hare, D. J., Kysenius, K., Paul, B., Knauer, B., Hutchinson, R. W., O’Connor, C., Fryer, F., Hennessey, T. P., Bush, A. I., Crouch, P. J., Doble, P. A. Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation – Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (119), e55042, doi:10.3791/55042 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image