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Medicina

Metalli di imaging in tessuto cerebrale di Laser Ablation - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa (LA-ICP-MS)

Published: January 22, 2017
doi:
10.3791/55042
, , , , , , , , , ,
1Elemental Bio-imaging Facility,University of Technology Sydney, 2Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,The University of Melbourne, 3Department of Pathology,The University of Melbourne, 4School of Earth Sciences,The University of Melbourne, 5Research School,Ruhr University, 6Department of Physiology,Monash University, 7ESI Ltd., Bozeman, 8Agilent Technologies, Mulgrave

Summary

Quantitativamente mappatura metalli in tessuto da ablazione laser – induttivo plasma ad accoppiamento – spettrometria di massa (LA-ICP-MS) è una tecnica analitica sensibile in grado di fornire nuovi indizi su come i metalli partecipare a normali processi di funzionamento e di malattia. Qui, descriviamo un protocollo per l'imaging quantitativo metalli in sezioni sottili di tessuto neurologico del mouse.

Abstract

I metalli sono presenti ovunque in tutto un organismo, il loro ruolo biologico dettato sia dalla loro reattività chimica e abbondanza all'interno di una specifica regione anatomica. Nel cervello, metalli hanno una distribuzione molto compartimentato, a seconda della funzione primaria giocano all'interno del sistema nervoso centrale. Imaging la distribuzione spaziale dei metalli ha fornito visione unica nell'architettura biochimico del cervello, permettendo correlazione diretta fra regioni neuroanatomiche e loro nota funzione con riferimento ai processi metallo-dipendente. Inoltre, diversi disturbi neurologici legati all'età dispongono interrotto l'omeostasi di metallo, che è spesso limitato alle piccole regioni del cervello che sono altrimenti difficili da analizzare. Qui, descriviamo un metodo completo per l'imaging quantitativamente metalli nel cervello del mouse, utilizzando ablazione laser – plasma accoppiato induttivamente – spettrometria di massa (LA-ICP-MS) e di elaborazione delle immagini appositamente progettatiSoftware. Concentrandosi su ferro, rame e zinco, che sono tre dei metalli più abbondanti e malattie rilevanti all'interno del cervello, si descrivono le fasi essenziali nella preparazione dei campioni, analisi, misurazioni quantitative e di elaborazione delle immagini per produrre mappe di distribuzione del metallo all'interno della bassa micrometro gamma risoluzione. Questa tecnica, applicabile a qualsiasi sezione di tessuto taglio, è in grado di dimostrare la distribuzione altamente variabile di metalli all'interno di un organo o sistema, e può essere utilizzato per identificare cambiamenti nella omeostasi metallo e livelli assoluti all'interno di strutture anatomiche sottili.

Introduction

Il redox chimica unica di metalli facilita una serie di funzioni neurologiche, tra cui trasduzione del segnale, la produzione di energia e la sintesi dei neurotrasmettitori. In una serie di importanti malattie neurodegenerative, dyshomeostasis di questi metalli sono stati entrambi implicati nella patogenesi della malattia e identificati come potenziali nuovi bersagli per l'intervento terapeutico 1. Per capire meglio come i metalli sono coinvolti in condizioni come il morbo di Alzheimer e il Parkinson (AD e PD, rispettivamente), è indispensabile per essere in grado di misurare quanto la distribuzione ei livelli di metallo cambiano all'interno delle regioni colpite dal processo della malattia. Questi cambiamenti sono spesso indicativi di cambiamenti sottili nelle reazioni biochimiche che possono essere intimamente legato ai processi che avviano la morte delle cellule, come il nostro recentemente proposto meccanismo di ferro e dopamina neurotossicità nel PD 2.

Tradizionalmente, metalivelli L all'interno di regioni anatomiche definite è stato raggiunto attraverso un attento escissione, la digestione e l'analisi utilizzando una gamma di tecniche analitiche 3. Tuttavia, un tale approccio perde l'informazione territoriale, che può essere critico quando gli stati di malattia in fase di studio riguardano le piccole, le regioni ben definite o tipi cellulari specifici. Un certo numero di metodi analitici sono disponibili per la visualizzazione metalli in sistemi biologici, dai campioni intatti a sezioni di tessuto e in due e tre dimensioni, usando spettroscopia di emissione, sonde fluorescenti e spettrometria di massa 4. Ogni tecnica ha vantaggi e svantaggi per quanto riguarda la sensibilità, la selettività di specie chimiche e la risoluzione spaziale che può essere raggiunto. Per una panoramica completa della gamma di tecniche disponibili, vedi la recensione di Hare et al. 5.

La spettrometria di massa (MS) a base di metodi sono più sensibili di queste tecniche, In grado di misurare i metalli più biologicamente rilevanti alla loro concentrazione nativa 6. Ablazione laser – plasma accoppiato induttivamente – spettrometria di massa (LA-ICP-MS) Imaging impiega un fascio laser ultravioletto concentrato di dimensioni variabili da 1 a> 100 micron di diametro (o larghezza, quando viene usata una forma del fascio quadrilatera), in cui la campione è passato 7. Le informazioni quantitative può essere ottenuto attraverso l'ablazione rappresentante di standard di riferimento, che può essere prodotto utilizzando una varietà di approcci differenti 8, ciascuno con diversi gradi di difficoltà tecnica e praticità analitica. L'approccio più comune utilizza l'accoppiamento alla matrice, in cui un campione con una composizione chimica predominante paragonabile a quella del campione viene preparato chiodare con l'analita bersaglio e accuratamente valutati per l'omogeneità e la concentrazione del metallo assoluta mediante analitici indipendenti 9, </sup> 10. Ablazione standard preparati può quindi essere utilizzato per scopi di taratura esterni, consentendo dati di concentrazione dall'immagine campione risultante da estrarre per pixel.

La risoluzione dell'immagine è determinato sia dalla dimensione del fascio e la velocità con cui viene analizzato il campione. Il quadrupolo-design standard ICP-MS (che rappresentano oltre il 90% di tutti i sistemi ICP-MS installate in tutto il mondo 11) è un analizzatore di massa sequenziale, in che il rilevatore di massa in sequenza tutti i rapporto massa-di-carica selezionate (m / z ) piuttosto che raccogliere dati simultaneamente. Così, il tempo di acquisizione per ciascun ciclo di masse deve uguagliare il tempo impiegato per il campione per attraversare una larghezza del fascio laser per garantire un rappresentante pixel della risoluzione desiderata è acquisito 12. Laser selezione della dimensione del fascio è un parametro fondamentale che ha effetti significativi sulla sensibilità e tempo di analisi totale. Come ablazione laser Physicamente rimuove il materiale che viene spazzato al ICP-MS da un gas di trasporto argon, la quantità di materia che può essere fisicamente rilevato dal analizzatore di massa segue la legge dell'inverso del quadrato. Ad esempio, la riduzione del diametro del fascio laser da 50 – 25 micron comporta una riduzione del materiale ablato di un fattore di quattro. Inoltre, come metodo di scansione, i diametri più piccoli fascio aumentano il tempo totale necessario per l'ablazione un'area selezionata. Pertanto, disegno sperimentale è essenziale per bilanciare la risoluzione spaziale necessaria con le esigenze di sensibilità e vincoli di tempo.

Imaging di LA-ICP-MS è stato applicato ad una gamma di campioni, matrici e stati di malattia, tra cui modelli animali di malattie neurologiche 13, 14, trauma cranico 15, la distribuzione, l'esposizione sostanza tossica di metallo contenenti farmaci antitumorali 16 nella placenta 17 e metallo distribution nei denti come biomarker di transizioni dieta precoce di vita. 18 In questo protocollo si descrive un metodo generale per l'imaging ferro, rame e zinco nel cervello di topo WT ad una risoluzione di 30 micron, anche se può essere facilmente adattato ad una gamma di campioni e risultati sperimentali, in base alle esigenze del analista.

Protocol

Le procedure descritte nel presente documento sono stati approvati dal Comitato Etico Florey animali Howard e rispettare le norme nazionali Salute e Medical Research Council di cura degli animali. 1. Preparazione del campione per l'analisi NOTA: Questo passaggio varia a seconda della matrice del campione da analizzare. Preparazione dei campioni e sezionamento NOTA: Fixation con 4% paraformaldeide (PFA) e crioprotezione nel 30% di saccarosio in 0.1 M PBS si tradurrà in quantità variabili di lisciviazione di metalli dal tessuto. Vedere Hare et al 19 per i dettagli specifici. Assicurarsi che tutti i campioni sono stati sottoposti a identici passi fissaggio e crioprotezione. Transcardially profumato l'animale eutanasia con ghiacciata 0,1 M PBS, pH 7.4 (vedere la sezione Metodi di Dodt et al. 20 per i dettagli) e rimuovere il cervello. Mettere il cervello in 4% PFA O / N per fissare il tessuto. <li> Cryoprotect cervello ponendolo in 30% di saccarosio in 0.1 M PBS per 24 ore, e poi cambiare fresco 30% di saccarosio per altre 24 ore. 19 Blocca il cervello in un criostato a -20 ° C per almeno 1 ora. Montare il cervello su un mandrino utilizzo di un supporto di montaggio adatta. Sezione del cervello su un criostato con una lama monouso priva di metallo (ad esempio, politetrafluoroetilene [PTFE] Rivestiti coltelli) e montare su un vetrino da microscopio standard. Lo spessore ottimale per la sezione deve essere di circa 30 micron. Se utilizzando campioni in paraffina, sezione allo spessore desiderato, galleggiare il nastro su un bagno di acqua calda e montare su vetrini da microscopio standard. NOTA: effetti precisi di fissazione a lungo termine e di paraffina-embedding di campioni biologici non sono noti. Come descritto al punto 1.1, assicurare tutti i campioni sono stati sottoposti a procedure di preparazione campione identico se l'analisi comparativa è destinato. sparaffinatura pacampioni Raffin-embedded immergendo il vetrino in 3 cambi di xilene, 1 cambio ciascuno di: 100% di etanolo, 95% di etanolo, etanolo al 70% e un minimo di 3 cambiamenti nella norma ISO 3696 o acqua purificata equivalente (qui di seguito, indicati come ' acqua '; vedere Hare et al 21 per un metodo dettagliato).. Lasciare campioni per asciugare per circa 1 ora in un ambiente privo di polvere, come ad esempio una casella di scorrimento con i campioni disposti verticalmente in rack e il coperchio lasciata socchiusa. 2. elaborazione di norme Matrix-abbinato NOTA: Il seguente è un protocollo riassunto pubblicato in precedenza 9. Si prega di consultare la carta originale per la procedura dettagliata per la preparazione standard Tissue Matrix-abbinato. Ottenere cervella di agnello commerciali (o simili) e sciacquare in acqua, la rimozione di tutto il sangue e del tessuto connettivo. Usando un bisturi, sezionare con cura di circa 50 g di tissu corticaleE e parzialmente omogeneizzare utilizzando un omogeneizzatore tessuto a mano con una sonda monouso in policarbonato a bassa potenza. Dividere in 5 g aliquote, con il numero a seconda del range di calibrazione e il numero di punti di calibrazione desiderati. Preparare soluzioni di metalli a picco ciascuno standard sciogliendo un sale solubile di ciascun analita (per esempio, FeSO 4 · H 2 O) in 1% di acido nitrico per produrre 0,1, 1 e 100 mg di metallo mL -1 scorte. Aggiungere un volume precalcolata della soluzione madre al 5 g di tessuto aliquotati (ad esempio, 5 ml di 10 mg mL -1 per una concentrazione finale di circa 10 mcg g -1 tessuto bagnato) per ottenere una gamma di livelli di metallizzazione a spillo ogni standard. A seconda della concentrazione finale desiderata di ogni standard, utilizzando una combinazione di ciascuna soluzione metallo stock per garantire la minima quantità di soluzioni vengono aggiunti allo standard. Aggiungere un picco finale di acqua per ogni standard per garantire equivolumi valente di liquido aggiunto è presente in ogni standard. Omogeneizzare gli standard a spillo a bassa potenza per circa 30 s. Se non deve essere utilizzato immediatamente, tenere congelato a -20 ° C in tubi in polipropilene con cappuccio sigillati con parafilm. Determinare la concentrazione esatta e omogeneità di ciascun standard utilizzando una delle seguenti procedure: Forno a microonde digestione Posizionare 6 accuratamente pesati (circa 50 mg) aliquote di uno standard in un vaso di digestione PTFE lavato e aggiungere 4 ml di concentrato (65%) di acido nitrico e 1 ml di acqua ossigenata al 30%. Sigillare e digerire a 500 W per 30 min. Dopo raffreddamento il vaso di digestione, aperta in una cappa aspirante e trasferire quantitativamente la soluzione digerita a un tubo 50 d'acido mL usando 10 aliquote mL di acqua. Rendere a circa 50 mL, e pesati la massa della soluzione finale. Ripetere i punti 2.5.1.1 – 2.5.1.2 per ogni standard. Utilizzare la seguente procedura se apparecchiature a microonde digestione non è disponibile: Mettere sei accuratamente misurati (tra 25-200 mg) aliquote della norma in / metal-free tubo lavata con acido polipropilene e lyophilize O / N. Aggiungere 40 ml di acido nitrico concentrato e calore, senza cappuccio, su una piastra riscaldante a 70 ° C per 5 minuti, quindi si aggiungono 10 ml di acqua ossigenata al 30%. Calore per ulteriori 5 minuti, e poi accuratamente far 1 ml di volume totale usando 950 ml di acido nitrico 1%. NOTA: Si consiglia di digerire un materiale di riferimento certificato utilizzando il metodo di scelta per garantire procedure di digestione sono accurate. Determinare la concentrazione del metallo in ciascuna soluzione digerire mediante solubilizzazione nebulizzazione ICP-MS utilizzando un protocollo standard. Valutare l'omogeneità di ogni standard determinando la deviazione standard relativa (% RSD) tra ciascuna aliquota. Garantire% RSD tutti rientrano entro il 15%. Utilizzando la massa misurata di EAch aliquota, calcolare la concentrazione di metallo precisa di ogni livello del tessuto omogeneizzato. Tornando allo standard tessuto omogeneizzato, imballare uno stampo istologia plastica monouso 5 x 5 mm e congelare in iso -pentane raffreddato in azoto liquido. Rimuovere il blocco di tessuto normale congelato dallo stampo e sezione su un criostato allo stesso spessore del campione. Nota: È consigliabile preparare un numero di sezioni a diversi spessori per esperimenti futuri. standard di aria secca possono essere conservati a tempo indeterminato in un contenitore a tenuta d'aria e privo di polvere. 3. Preparazione di LA-ICP-MS per l'analisi norme luogo e campione nella camera di ablazione, assicurando che siano all'interno della profondità di campo della telecamera CCD montato l'unità di Los Angeles. Se la sintonizzazione dello strumento è necessario includere un adatto materiale di riferimento (ad esempio, NIST 612 oligoelementi in vetro). Serrare le due viti sulla porta della camera per sigillare °e camera di ablazione. Nel software ICP-MS, selezionare aperta la valvola del gas argon nel 'manutenzione' o il pannello simile e impostare il flusso di gas di trasporto di 1,2 L min -1 nella finestra di dialogo appropriata. NOTA: In questo argon protocollo viene utilizzato come gas di trasporto. Diversi esempi utilizzano sia elio o una miscela di elio e argon come gas di trasporto. Vedere Günther e Heinrich 22 per i dettagli tecnici per l'utilizzo di elio e miscele di argon come gas di trasporto di aerosol. Nel software Los Angeles, fare clic sul pulsante 'epurazione' per svuotare la cella con gas argon per un minimo di 30 min. NOTA: il tempo di spurgo può essere modificato facendo clic su un 'tempo di spurgo' o un pulsante simile. Quando si utilizza un sistema di ablazione con una cella di ablazione due volumi, spostare periodicamente la fase a ciascun angolo e diagonalmente attraversare la cella per garantire una quantità di aria residua viene rimossa dalla cella possibile. Ciò può essere ottenuto selezionando il 'stadi di casa' o equivFunzione valente. Accendere l'ICP-MS cliccando 'plasma' e lasciare riscaldare per due ore, durante le quali passi 3,5-4,4 può essere effettuata. Impostazioni dello strumento a seconda del produttore, anche se un esempio di adeguate condizioni di esercizio LA-ICP-MS può essere trovato in Hare et al. 10. ablazione Rappresentante degli standard di tessuto Selezionate lo strumento linea e tracciare una singola linea di ablazione di circa 3 mm di lunghezza su tutta la superficie del tessuto. Impostare i parametri come segue facendo clic destro sulla linea di ablazione nella lista esperimento e modificando la seguente: diametro del fascio (scelte in modo appropriato da parte dell'utente, un fascio di piazza 30 micron è usato qui), velocità di scansione (4 volte il diametro del raggio al secondo; 120 micron s -1) e fluenza di energia (0,3 -0.5 J cm -2 per i tessuti molli; ottimizzare, se necessario, per le matrici più difficile). Al 30 micron spessore del tessuto del fascio laser non penetra il pieno thickness di questo tessuto, eliminando qualsiasi potenziale contaminante dal supporto microscopio. Normalizzazione di carbonio 23 può essere utilizzato per correggere la variazione nella quantità di tessuto ablato. Impostare questi parametri come predefinito per ogni riga successiva selezionando il pulsante 'default' della radio. Duplica questa linea sei volte selezionando la linea iniziale, tasto destro del mouse e selezionando 'scansioni duplicati. Assicurarsi che le linee sono compensate in entrambi i x – o l'asse Y dal diametro del fascio. Questo dà un totale di sette linee per standard distanziata secondo il diametro del fascio. Ripetere i punti 3.5.1 – 3.5.3 per ogni standard, garantendo la linea di lunghezza identica. Per disegnare la zona di ablazione sul campione, seguire uno dei due metodi seguenti: NOTA: Assicurarsi che gli stessi parametri di scansione (diametro del fascio, la velocità di scansione, fluenza di energia) vengono utilizzati per le linee di campionamento. Se il sistema LA è dotato di unampio campo di vista, selezionare lo strumento linea e tracciare una linea dall'angolo in alto a sinistra del campione abbastanza a lungo per coprire il campione nel suo punto più largo utilizzando gli stessi parametri laser descritte in 3.5. Duplicate questa scansione come indicato in 3.5.3 con linee distanziate secondo il diametro del fascio le volte necessarie per garantire la copertura completa del campione. Se un ampio campo vista non è disponibile, determinare e registrare le coordinate X e Y (tipicamente mostrato sulla schermata principale come 'posizione stadio' o simile) corrispondente agli angoli di un rettangolo che copre l'intero campione. Utilizzare queste coordinate per posizionare linee parallele di ablazione che coprono l'intera area del campione come descritto in 3.7.1. Tracciare le linee per la scansione intermittente di standard al più tardi dopo ~ 20 ore di scansione del campione ripetendo il processo descritto al punto 3.5. A seconda della durata della scansione del campione puo essere richiesto più volte. Terminare l'esperimento con un addiscansione zionale degli standard. NOTA: Nel determinare le coordinate X e Y, mentre la cella viene spurgato, selezionando le posizioni iniziali e la calibrazione associate dell'asse cambierà precedentemente acquisito specifiche per le coordinate x ed y che la differenza (ossia la lunghezza della linea) sarà inalterato. 4. Configurazione dei dati metodi di acquisizione per la ICP-MS Per la linea standard di ablazione, dividere la lunghezza della linea dalla velocità di scansione laser per determinare il tempo di analisi totale per una singola linea. Ripetere questa operazione per la linea del campione. Nel software ICP-MS, creare un nuovo metodo (qui come un 'gruppo') e verificare che 'i tempi di analisi risolto' o viene selezionato equivalente. Selezionare i valori m / z da rilevare, e quindi regolare il tempo di integrazione per ogni m / z in modo che il tempo totale di integrazione per un ciclo è uguale a 0,25 s. Fai clic su 'Salva Batch Come 'e il nome di conseguenza (per esempio, STD1). NOTA: Quando il campione attraverserà il fascio laser a quattro volte il diametro del fascio, questo assicura un punto dati per ciascuna massa viene registrato equivalente al diametro del fascio 12. Per esempio, utilizzando una dimensione di 100 micron spot, una velocità di scansione di 400 micron s -1 con un tempo di integrazione di 0,25 s produrrà immagini con dimensioni di pixel veri. Tempo di integrazione può essere regolata per migliorare la sensibilità; quando si aumenta il tempo di integrazione per 0,33 s velocità di scansione deve essere ritardato a tre volte il diametro del fascio. Per gli standard, inserire il tempo di analisi per ogni scansione riga nella casella appropriata, più altri 15 s per tenere conto di laser warm-up e tempi di washout. Inserire un elenco run campione (cioè l'ordine in cui vengono eseguite scansioni) con lo stesso numero di acquisizioni (sequenzialmente tipicamente numerati, cioè 001, 002, etc.) come il numero totale di righe standard. Per il campione, Duplicare il metodo utilizzato per gli standard salvando il metodo corrente o batch con un nome di file alternativo, e regolare il tempo totale di acquisizione (inclusi gli altri 15 s) e il numero totale di acquisizioni in base al numero di righe che l'ablazione del campione . NOTA: Poiché la maggior parte dei sistemi LA-ICP-MS usano un trigger unidirezionale (LA innesca ICP-MS), è essenziale che il software ICP-MS attende il trigger dal LA prima della successiva linea di ablazione inizio. La finestra di acquisizione ICP-MS leggerà 'di attesa per l'avvio'. 5. L'esecuzione del Experiment Avviare la coda ICP-MS aggiungendo il primo metodo o lotto alla coda e assicurarsi che il software attende il trigger dal sistema LA. Nel software Los Angeles, attivare l'alimentazione elettrica del laser cliccando 'emissione', clicca su 'run' ed impostare il tempo di riscaldamento del laser a 10 s e il tempo di wash-out di 20 s nelle caselle appropriate. Nota: Tale superamentogarantire la ICP-MS è pronto per iniziare acquisire nuovi dati quando il laser inizia ogni riga successiva di ablazione. Avviare la sequenza laser cliccando su 'Start'. Se si utilizza una cella in due volumi, garantire la coppa del campione è in posizione. 6. Calcolo di quantificazione Standards NOTA: Ci sono molteplici variazioni per la conversione dei dati ICP-MS in immagini. Questi includono l'uso di strumenti software casalinghe scritti in linguaggi open-source 17, 24, 25, le macro commerciali 26 e dati software di analisi. 7 Qui, utilizzare il recentemente sviluppato software plugin (descritto in Paul et al. 27), sulla base di una specializzazione LA-ICP-MS analisi dei dati interno 28. Trasferire tutte le cartelle contenenti i lotti dati della corsa (001.d, 002.d, ecc.) Ad uncomputer separato con il software di analisi installato. Estrarre i file di dati * .csv per ogni linea del lotto in una cartella separata. NOTA: Utilizzo di uno script per trasferire automaticamente i file * .csv in una nuova cartella è altamente raccomandato. Vedere codice Python allegato per maggiori dettagli. Questo script è stato scritto per soddisfare sia un Agilent 7700 o 8800 Series ICP-MS, ma può essere modificato per soddisfare il file di output di altri produttori. Aprire la piattaforma software e seguire le linguette sequenzialmente per importare e analizzare le norme per produrre immagini quantitativi come descritto di seguito. Per importare i dati del primo lotto standard, selezionare 'Agilent .csv' per 'Tipo di file', 'Tutta la cartella' per 'tipo Importa' e controllare che il 'Formato data' è identico al formato del computer. Fare clic su 'Importa', selezionare la cartella contenente i file .csv-per la prima serie di norme, e passare alla scheda 'Linee di base. Baselinesottrazione Utilizzare la scheda 'Selezioni automatico' (comando 2) dal menu principale dell'applicazione discesa nella barra degli strumenti, selezionare 'Informazioni da importazione' e cliccare su 'Continua'. Fare clic su 'Seleziona tutto' e selezionare 'Baseline_1' per l'integrazione. Per selezionare i primi 10 s di ciascuna linea di scansione (corrispondente al laser tempo di riscaldamento), ritagliare i dati accedendo secondo valori '0' e '(la durata della linea – 10 s)' e cliccare su 'Aggiungi integrazioni' (ad esempio, , per linea di scansione di 35 s, immettere i valori '0' e '25'). Per selezionare i dati di esempio, utilizzare la scheda 'Selezioni automatici', come descritto al punto 6.4, ma scegliere 'OUTPUT_1' come l'integrazione. Dati ritaglio dalla all'inizio e alla fine di ogni linea standard per escludere il segnale di fondo (ad esempio per una linea di scansione 35 s, immettere valori '13' e '4'). Per escludere gocce nel segnale causato dalla posfori ble nelle norme, nella scheda 'Campioni', clicca su 'canali' in alto a sinistra dell'area di grafico per selezionare un canale con un elevato rapporto segnale-rumore (ad esempio, C13 o P31). Prendere nota di eventuali gocce taglienti nel segnale e selezionare un valore CPS abbastanza basso che è al di sotto della normale variazione all'interno dei campioni, ma abbastanza alto per cogliere le forti cadute di segnale. Fare clic sulla scheda 'DRS' e selezionare 'Baseline_Subtract' per il 'attuale piano di riduzione dei dati'. Scegliere il canale da 6.6 per 'Channel Index' e il valore di CPS per 'Soglia da utilizzare quando mascherare segnali bassi'. Inserire un valore <0,5 s per 'secondi per tagliare prima / dopo i segnali bassi' per tenere conto per il ritardo nel trasferimento del segnale dal laser alla ICP-MS. Per confermare un adeguato mascheramento delle zone basse del segnale, cliccare di nuovo alla scheda 'Campioni' e selezionare una traccia di canale elaborati (ad es., Fe56_CPS). Ripetere e perfezionare la CPS e & #39; secondi per tagliare prima / dopo bassi valori di segnali 'come in 6.7, se necessario. Fare clic sulla scheda 'Risultati' e selezionare 'i dati Export' dal menu principale dell'applicazione discesa. Inserire un nome di file per generare un file di dati foglio di calcolo dei risultati (ad esempio, i calcoli STD1, Std2 …). Aprire il file di dati in un opportuno programma di foglio di calcolo e calcolare i valori CPS per ogni singolo canale da quantificato. Utilizzare le concentrazioni di metalli predeterminati dalla soluzione nebulizzazione ICP-MS per calcolare il fattore di conversione da valori CPS a ppm (mg g -1) per ogni elemento quantificabile. Ripetere i passaggi 6,3-6,10 per tutti i set di standard nella corsa. 7. Costruire Immagini Quantitative Scrivere 'Biolite ()' nel prompt dei comandi per aprire il software. Importare i dati di esempio facendo clic su "Carica immagini" e selezionando la cartella contenente i file CSV-FOR L'immagine del campione. correzione del fondo Fare clic sulla scheda "linee di base degli applicare la correzione del fondo per il campione. Sul fosforo immagine (P31) ha spinto sullo schermo, selezionare le aree dello sfondo utilizzando lo strumento rettangolo sorteggio. Selezionando il maggior numero di regioni possibile crea una mappa immagine a livello di segnale di deriva / plasma al fine di garantire un adeguato risarcimento da questi fattori confondenti. Per rendere il segnale di fondo più visibile, selezionare lo strumento grafico di modifica (in alto a sinistra dell'immagine visualizzata) e fare clic destro sull'immagine. Selezionare 'Modifica Aspetto dell'immagine' e cambiare il 'primo colore a Z =' su un valore negativo (ad es -100.000). Procedere facendo clic su 'Fatto'. Fare clic sulla scheda 'standard' per aprire un tavolo per fattori di correzione CPS / ppm. Inserire valori calcolati dalle norme in passaggio 6.10 per ciascuno degli elementi. Questo passaggio aiuterà a correggere la deriva sensibilità nella ICP-MS. Fare clic su 'Go! ' Apri 'Data Browser' dalla scheda 'Data', che contiene le immagini per ogni elemento e ogni passo. Per finalizzare l'immagine per l'esportazione, selezionare l'immagine desiderata nella cartella 'StdCorrImages', fare clic destro sul nome dell'immagine (* _ppm) e fare clic su 'NewImage'. Pulsante destro del mouse sull'immagine per aprire 'Modifica Aspetto dell'immagine' di scegliere una scala di tabella di colore e il colore desiderato. Aggiungere una scala di colori per l'immagine facendo clic destro sull'immagine e selezionando 'Aggiungi annotazione'. Seleziona 'ColorScale' dal menu a tendina in alto a sinistra e utilizzare le schede per modificare la scala colore desiderato. Per esportare un'immagine, assicurarsi che sia selezionata l'immagine in questione e passare alla scheda 'File' e cliccare su 'Salva la grafica …'. Selezionare il formato desiderato e salvare l'immagine. In alternativa, l'immagine selezionata può essere trasferita utilizzando gli strumenti di copia e incolla. Ripetere i punti 7.6 e 7.7 per tutte le immagini di interesse. Quantifying regioni discrete Per attivare gli strumenti di ROI, accedere alla scheda, 'pacchetti' 'analisi' e selezionare 'Image Processing'. Selezionare l'immagine desiderata e passare alla scheda 'Immagine' e cliccare su 'ROI …'. Fai clic su 'Start ROI pareggio' e utilizzare uno strumento di disegno per selezionare una regione di interesse nel campione. Per finire disegno, fare clic su 'Fine ROI'. Per acquisire le statistiche per il ROI selezionato, passare alla scheda 'Immagine' e cliccare su 'Statistiche …'. Copia e incolla i risultati in un foglio di calcolo separato. Ripetere la selezione ROI (7.9.2) per tutte le regioni e gli elementi di interesse.

Representative Results

Per dimostrare le capacità di questo approccio di imaging LA-ICP-MS, un semplice esperimento utilizzando una singola sezione di un WT C57BL / 6 cervello di topo, diviso in due al corpo calloso e sezionato nel piano coronale, è presentato. Un flusso di lavoro per l'analisi dei dati utilizzando Biolite (Figura 1), come descritto nelle sezioni 6 e 7, nonché per fornire un'immagine rappresentativa di distribuzione del metallo nella sezione analizzata (Figura 2) è anche descritto. Come si vede, la distribuzione di metallo nel cervello di topo è variabile a seconda della regione anatomica. Questo può essere attribuito ai ruoli metalli variabile, e più specificamente le proteine a cui sono legati, giocare in ciascuna regione cerebrale 27. Per esempio, il ferro tende ad avere concentrazioni più elevate nel mesencefalo e lungo il giro dentato, mentre lo zinco è più abbondante nel Cortiaree cal. Carbon, che è uno standard interno comunemente usato 8, viene omogeneamente distribuito. Mappe Elemental (figura 2) può essere particolarmente utile quando usato in combinazione con atlanti di riferimento anatomici e funzionali esistenti 29, in cui le informazioni sul colocalizzazione dei metalli può l'espressione di proteine specifiche metallo-legante può fornire comprensione della funzione di metalli all'interno di un cervello regione, o cambiamenti nei livelli di metallo in linea con un biomolecole correlata alla malattia identificata. Utilizzando l'approccio descritto, che è ottimizzato per una più ampia gamma di analiti, preclude la sensibilità per gli elementi poco abbondanti come il manganese, e metodi possono essere adattati per concentrarsi principalmente su questo analita aumentando tempi di sosta a scapito di altre masse misurate. Il principale vantaggio nell'utilizzo di immagini di LA-ICP-MS sta osservando differenze relative a Conc metallozione e la distribuzione tra i gruppi sperimentali. Abbiamo precedentemente utilizzato tale tecnica per dimostrare un aumento del ferro dopo un insulto neurotossina imitando PD 2, 10, e cambiamenti nei livelli di ferro corticali in tessuto morbo di Alzheimer umano 21. Tale protocollo, come descritto qui può essere facilmente adattato a qualsiasi altro tipo di tessuto con modifiche minime ai metodi elencati. Figura 1: Flusso di lavoro per l'elaborazione dell'immagine. Workflow complementari a sezioni 6 e 7, raffiguranti la conversione dei dati in tempo grezzi risolti dalla ICP-MS per immagini quantitativi di distribuzione del metallo nel cervello di topo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. </p> Figura 2: Tipico Distribuzione Elemental di Biometals all'interno di un cervello di topo. mappe elemento rappresentativo di una sezione coronale 30 micron di spessore di un singolo emisfero cervello di topo analizzate con LA-ICP-MS. Immagini per il carbonio-13 (C13), il magnesio-24 (MG24) e fosforo-31 (P31) visualizzati in scale di colore oro (conteggi per secondo; CPS) (riga superiore). Immagini quantitativi (riga inferiore) per il manganese-55 (Mn55), rame-63 (Cu63), ferro-56 (Fe56) e zinco-66 (Zn66) visualizzati con scale di colore corrispondenti BlueHot (mg g-1). tempo di analisi totale per la sezione del cervello è stato di circa 5 h. Barra di scala = 2 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <strong> Codice supplementare sul file 1. Open-source codice Python indicato al paragrafo 6.1, che può essere modificato utilizzando un editor di Python appropriata in base al metodo di uscita dei dati di ICP-MS produttore. Clicca qui per scaricare il file.

Discussion

metalli di imaging nei tessuti neurologici è solo un esempio di come questo protocollo può fornire informazioni utili sulla distribuzione e la quantità di metalli in qualsiasi matrice biologica. Anche se la preparazione di materiali di riferimento standard può essere arduo, si tratta di un esperimento che può essere eseguito una sola volta e archiviati per un uso successivo.

LA-ICP-MS ha alcuni vantaggi rispetto ai metodi alternativi, come la microscopia a fluorescenza a raggi X di sincrotrone a base, per lo più in termini di accessibilità e sensibilità. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi che dovrebbero essere considerati quando si prepara un esperimento utilizzando LA-ICP-MS, e come tale è spesso una tecnica complementare utile per l'imaging chimica che include tecniche di analisi metallo alternative, nonché istochimica comparativo 5.

L'allineamento con note caratteristiche anatomiche del cervello di topo può fornire informazioni utili sul possibile relati funzionaleonship tra i livelli di metallo e distribuzione spaziale. In precedenza, abbiamo utilizzato la risorsa online Allen Cervello Atlas, 29 che è un archivio ad accesso aperto di entrambi i dati di espressione anatomici e gene nel cervello dei topi C57BL / 6 per esaminare la correlazione spaziale di entrambi espressione dell'enzima metallo-dipendente 14 e neuroanatomia 27, 30. Altre risorse, come WorkBench roditore cervello 31 sono disponibili per assistere con la registrazione e l'allineamento di immagini di metallo per facilitare la corretta identificazione di distribuzione del metallo in spesso piccole regioni anatomiche anche.

Applicazioni di questa tecnica sono utili nella valutazione dei livelli come metallo e modifica la distribuzione alla microscala in entrambi normali eventi della vita (ad esempio, invecchiamento) e negli stati di malattia; oltre a studiare gli effetti di entrambi i composti contenenti metalli e farmaci progettati per me bersagliometabolismo Tal. Gli attuali limiti principali di LA-ICP-MS come una tecnica di imaging per valutare la distribuzione spaziale di metallo sono il throughput e la sensibilità. Vi è un compromesso tra velocità di analisi e risoluzione spaziale 5, 12, con immagini ad alta risoluzione richiedono tempi di analisi più lunghi. La tecnica è adatta a elementi biologici a concentrazioni più elevate, anche se elementi come manganese, cobalto e selenio sono limitati a causa della loro bassa abbondanza nel tessuto normale e / o limitazioni nella loro individuazione mediante convenzionale ICP-MS. Nuovi progressi nella tecnologia ICP-MS, come l'introduzione di analizzatori di massa triplo quadrupolo, consentono il rilevamento mirato di analiti difficili, come selenio 32 a sensibilità superiori 33. Come procedura guidato dalla tecnologia, i progressi sia nel laser e la progettazione spettrometria di massa vedranno questa tecnica di imaging continuano ad evolversi, aumentandola velocità di analisi e sensibilità 34.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DJH e PAD sono supportate da un legame Progetto Australian Research Council (LP120200081) con Agilent Technologies e il TFR Ltd. Il contributo di BK è stato sostenuto dalla Ruhr University Research Scuola PLUS, finanziato dal eccellenza iniziativa della Germania [DFG GSC 98/3]. DJH è stato in parte sostenuto dalla Fondazione Ramaciotti. KK è sostenuta dalla Fondazione Juselius Sigrid.

Materials

Soda glass microscope slides n/a n/a Typical slides are suitable for all experiments
PTFE-coated microtome blades C.L. Stuckey DT315R50 Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering.
Parafomaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Any supplier suitable
Sucrose n/a n/a Commercial grade white sugar is suitable
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P5368 Pre-mixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols
Xylene Sigma-Aldrich 247624 Any supplier suitable
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Any supplier suitable
Lamb brain n/a n/a Available from most local butchers
Metal salts n/a n/a Use water soluble metal salts containing desired analytes
Omni TH Tissue Homogeniser Omni Inc THP115 Alternative homogenizers are suitable
Polycarbonate homgenizer probes Omni Inc TH115-PCRH
Microwave digestion unit n/a n/a Optional. See Section 2
1.5 mL microfuge tubes TechnoPlas P4010 Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable
65% nitric acid Merk Millipore 100441 Trace analysis grade
30% hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 95321 Trace analysis grade
10 x 10 mm disposable cryomolds Ted Pella 27181
Iso-pentane Sigma-Aldrich 76871
Liquid nitrogen n/a n/a Use local supplier
NWR213 Laser Ablation system ESI Ltd n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Agilent 8800 Series ICP-MS Agilent Technologies n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Iolite Iolite Software n/a Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol
Excel Microsoft n/a
IGOR Pro Wave Metrics n/a Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm
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Riferimenti

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Hare, D. J., Kysenius, K., Paul, B., Knauer, B., Hutchinson, R. W., O’Connor, C., Fryer, F., Hennessey, T. P., Bush, A. I., Crouch, P. J., Doble, P. A. Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation – Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (119), e55042, doi:10.3791/55042 (2017).
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