Kantitatif lazer ablasyon ile dokuda metallerin haritalama – indüktif eşleşmiş plazma – kütle spektrometresi (LA-ICP-MS) metaller, normal fonksiyon ve hastalık sürecine katılmaları nasıl yeni bir fikir verebilir hassas bir analitik tekniktir. Burada, kantitatif fare nörolojik doku ince kesitlerde metal görüntüleme için bir protokol açıklar.
Metaller, belirli bir anatomik bölgede hem kimyasal reaktivite ve bolluk tarafından dikte biyolojik rolü, bir organizmanın boyunca yayg bulunur. beyin içinde, metaller, merkezi sinir sistemi içinde oynayabilir birincil işlevi ile ilgili olarak, bir yüksek bölümlere dağılımına sahiptir. Metallerin mekansal dağılımının görüntülenmesi Nöroanatomik bölgeler ve metal bağımlı süreçlerle ilgili kendi bilinen fonksiyonu arasındaki doğrudan bir ilişki sağlayan beynin biyokimyasal mimarisine benzersiz bir bakış açısı sağlamıştır. Buna ek olarak, çeşitli yaş ile ilişkili nörolojik bozukluklar genellikle, aksi analiz etmek zordur beynin küçük bölgelerle sınırlı metal homeostazını kesintiye sağlarlar. Burada, lazer ablasyon kullanarak, nicel fare beyninde metalleri görüntüleme için kapsamlı bir yöntem tarif – indüktif eşleşmiş plazma – kütle spektrometresi (LA-ICP-MS) ve özel olarak tasarlanmış görüntü işlemeyazılım. beyin içinde en bol ve hastalık ilgili metallerin üç olan demir, bakır ve çinko, üzerinde yoğunlaşırken, biz düşük mikrometre içindeki metal dağılımının haritalar üretmek için numune hazırlama, analiz, kantitatif ölçümler ve görüntü işleme temel adımları açıklar çözünürlük aralığı. herhangi bir kesim doku bölümü için geçerli Bu teknik, bir organ ya da sistemde metallerin oldukça değişken dağılımı sergileyebilme yeteneğine sahip olduğunu ve gayet iyi anatomik yapıların içindeki metal homeostazında değişiklik ve mutlak düzeylerini belirlemek için kullanılabilir.
Metallerin eşsiz redoks kimyası sinyal iletimi, enerji üretimi ve nörotransmitter sentezi de dahil olmak üzere nörolojik fonksiyonları, bir dizi kolaylaştırır. En temel nörodejeneratif hastalık, bir dizi, bu metallerin dyshomeostasis iki hastalıkta patogenezinde ve terapötik müdahale 1 potansiyel yeni hedeflerin olarak tanımlanmıştır. Daha iyi metaller Alzheimer ve Parkinson hastalığı (AD ve PD, sırasıyla) olarak koşullarda katılmaktadırlar anlamak için, metal dağıtım ve seviyeleri olumsuz hastalık sürecinden etkilenen bölgeler içinde nasıl değiştiğini ölçebilmek için zorunludur. Bu değişiklikler genellikle yakından böyle PD 2 demir ve dopamin nörotoksisitenin bizim son zamanlarda önerilen mekanizma olarak, hücre ölümünü başlatmak süreçlerle bağlantılı olabilir biyokimyasal reaksiyonlarda ince vardiya göstergesidir.
Geleneksel olarak, bir metatanımlanmış anatomik bölgeler içinde l seviyeleri analitik teknikler 3 bir dizi kullanarak dikkatli eksizyonu, sindirim ve analiz yoluyla elde edilmiştir. Ancak, böyle bir yaklaşım hastalık durumları incelenmiştir küçük, iyi tanımlanmış bölgeler veya belirli hücre tiplerini içeren edilirken kritik olabilir uzamsal bilgiyi kaybeder. Analitik bir dizi yöntem emisyon spektroskopisi, floresan probları ve kütle spektrometresi 4 kullanılarak sağlam örneklerinden doku bölümleri ve iki ve üç boyutlu olarak biyolojik sistemlerde metaller, görselleştirmek için kullanılabilir. Her teknik hassasiyet, kimyasal türlerin seçicilik ve elde edilebilir uzaysal çözünürlüğü ile ilgili avantajları ve dezavantajları vardır. Mevcut tekniklerin aralığında kapsamlı bir bakış için, Hare ve arkadaşları tarafından gözden bakın. 5.
Kütle spektrometrisi (MS) yöntemleri, bu tekniklerin en duyarlı tabanlı, Kendi ana konsantrasyonda 6 en biyolojik ilgili metalleri ölçebilen. Lazer ablasyon – indüktif eşleşmiş plazma – kütle spektrometresi (LA-ICP-MS) görüntüleme (bir dörtgen ışın şekil kullanılır veya genişlik)> çapı 100 mikron 1 arasında değişen büyüklüklerde odaklanmış morötesi lazer ışınını, istihdam altında örnek 7 geçirilir. Nicel bilgiler farklı yaklaşımlar 8, teknik zorluk ve analitik pratiklik değişen derecelerde her çeşitli kullanılarak üretilebilir standart referans malzemelerin temsili ablasyon yoluyla elde edilebilir. En yaygın yaklaşım, numunenin karşılaştırılabilir baskın kimyasal yapısına sahip, standart bağımsız analiz vasıtasıyla 9 ile homojenliğe ve mutlak metal konsantrasyonu açısından değerlendirildi doğru hedef analit ile spike hazırlanabilir ve matris eşlemeyi kullanır </sup> 10. Hazırlanan standartların ablasyon daha sonra sonuçta meydana gelen örnek bir görüntü konsantrasyonu verileri piksel başına ekstre sağlayan dış kalibrasyon amaçlı kullanılabilir.
Resim çözünürlüğü kiriş boyutu ve örnek taranır hızına tarafından belirlenir. (Dünya çapında tüm yüklü ICP-MS sistemleri 11% 90'ından sorumludur), standart dört kutuplu tasarım ICP-MS seçilen tüm kütle-ücret oranı ile kitle detektörü döngüleri, sıralı kütle analizörü (m / z ) yerine eş zamanlı olarak veri toplamak daha. Bu nedenle, kitlelerin her bir döngü için elde etme zamanı, istenen çözünürlük piksel temsilci 12 elde edilir sağlamak için, lazer ışınının bir genişliği hareket örnek için alınan zaman eşit olmalıdır. Lazer ışın boyutu seçimi duyarlılık ve toplam analiz süresi hem de önemli etkilere sahip olan bir çok önemli bir parametredir. lazer ablasyon fiziksel durumları olarakCally'nin argon taşıyıcı bir gaz ile, ICP-MS süpürülür malzemenin fiziksel kütle analizörü ile tespit edilebilir madde miktarı ters kare kanununa göre hareket kaldırır. dört kat ablasyon malzemenin bir azalma 25 um sonuç – Örneğin, 50, lazer ışını çapının azaltılması. Ayrıca, bir tarama yöntemi olarak, daha küçük kiriş çapları seçilen bir alanı baskılamak için gereken toplam süreyi artırır. Bu nedenle, deneysel tasarım duyarlılık ihtiyaçları ve zaman kısıtlamaları gerekli uzaysal çözünürlük dengelemek için esastır.
LA-ICP-MS ile görüntüleme nörolojik bozuklukların 13, 14, travmatik beyin yaralanması, 15 plasentada metal içeren anti-kanser ilaçları, 16 zehirli maruz dağılımı hayvan modellerinde de dahil olmak üzere, örnekler, matris ve hastalıkların bir dizi tatbik edilmiştir 17 ve metal distrErken yaşam diyet geçişler bir biyolojik belirteç olarak dişlerde ibution. Kolayca örnek türleri ve deneysel sonuçlar bir dizi adapte edilebilir olsa bu protokol 18 biz ihtiyaçlarına göre, 30 mikron çözünürlükte WT fare beyin demir, bakır ve çinko görüntüleme için genel bir yöntem tarif analisti.
Nörolojik dokusunda görüntüleme metaller bu protokol herhangi bir biyolojik matris içinde metallerin dağılımı ve miktarı hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir nasıl sadece bir örnektir. standart referans malzemelerin hazırlanması zorlu olabilir rağmen, bir kez gerçekleştirilir ve daha sonra kullanılmak üzere arşivlenebilir bir deneydir.
LA-ICP-MS, çoğunlukla erişilebilirlik ve duyarlılık açısından böyle sinkrotron tabanlı X-ışını floresan mikroskop gibi alternatif yöntemler üzerinde bazı avantajlara sahiptir. Ancak, LA-ICP-MS kullanılarak bir deney hazırlanırken dikkate alınması gereken bazı dezavantajları vardır, ve gibi genellikle alternatif metal analiz teknikleri yanı sıra karşılaştırmalı histokimya 5 içerir kimyasal görüntüleme için yararlı bir tamamlayıcı bir tekniktir.
fare beyninin bilinen anatomik özellikleri ile uyum olası fonksiyonel relati hakkında yararlı bilgiler sağlayabilirmetal düzeylerinin ve mekansal dağılımı arasındaki öğrenmekten yararlanma. Daha önce, Allen Beyin Atlas online kaynak, hem metal bağımlı enzim ifade 14 ve nöroanatomi 27 uzaysal korelasyonu incelemek için C57BL / 6 fare beyninde hem anatomik ve gen ifade verilerinin açık erişim depodur 29 kullandık, 30. Böyle Kemirgen Beyin WorkBench 31 gibi diğer kaynaklar da genellikle küçük anatomik bölgelerde metal dağılımının doğru teşhisinde yardımcı olmak için kayıt ve metal görüntüleri hizalama yardımcı vardır.
Bu tekniğin Uygulamaları, normal yaşam olayları hem boyunca mikroölçeklerde nasıl metal düzeyleri ve dağıtım değişikliği değerlendirmede yararlıdır (örneğin, yaşlanma) ve hastalık durumlarında; olarak tasarlanan iki metal ihtiva eden bileşikler ve uyuşturucu etkilerini araştırmak beni hedeftal metabolizması. mekansal metal dağılımı değerlendirmek için bir görüntüleme tekniği olarak LA-ICP-MS mevcut büyük sınırlamalar çıktı ve hassasiyet vardır. Uzun analiz süreleri gerektiren yüksek çözünürlüklü görüntüleri ile analiz hızı ve uzamsal çözünürlük 5, 12 arasında bir değiş tokuş vardır. manganez, kobalt ve selenyum gibi elementler ICP-MS ile bunların tespit normal doku ve / veya sınırlamalar düşük çokluğu nedeniyle sınırlıdır da teknik, yüksek konsantrasyonlarda biyolojik elemanları uygundur. Bu tür üçlü dört kutuplu kütle analizörleri giriş olarak ICP-MS teknolojisinde yeni gelişmeler, yüksek hassasiyetleri 33 böyle selenyum 32 gibi zor analit, hedeflenen tespiti için izin verir. Bir teknoloji odaklı bir prosedür olarak, artan teknik gelişmeye devam bu görüntüleme göreceksiniz lazer ve kütle spektrometresi tasarımı hem de gelişmeleranaliz ve duyarlılık 34 hızı.
The authors have nothing to disclose.
DJH ve PAD Almanya'nın Mükemmellik Girişimi [DFG GSC 98/3] tarafından finanse Ruhr Üniversitesi Araştırma Okulu PLUS, tarafından desteklenmiştir Agilent Technologies ve ESI Ltd. BK katılım Avustralya Araştırma Konseyi Bağlantı Projesi (LP120200081) tarafından desteklenmektedir. DJH kısmen Ramaciotti Vakfı tarafından desteklenmiştir. KK Sigrid Juselius Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Soda glass microscope slides | n/a | n/a | Typical slides are suitable for all experiments |
PTFE-coated microtome blades | C.L. Stuckey | DT315R50 | Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering. |
Parafomaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Any supplier suitable |
Sucrose | n/a | n/a | Commercial grade white sugar is suitable |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P5368 | Pre-mixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols |
Xylene | Sigma-Aldrich | 247624 | Any supplier suitable |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Any supplier suitable |
Lamb brain | n/a | n/a | Available from most local butchers |
Metal salts | n/a | n/a | Use water soluble metal salts containing desired analytes |
Omni TH Tissue Homogeniser | Omni Inc | THP115 | Alternative homogenizers are suitable |
Polycarbonate homgenizer probes | Omni Inc | TH115-PCRH | |
Microwave digestion unit | n/a | n/a | Optional. See Section 2 |
1.5 mL microfuge tubes | TechnoPlas | P4010 | Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable |
65% nitric acid | Merk Millipore | 100441 | Trace analysis grade |
30% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 95321 | Trace analysis grade |
10 x 10 mm disposable cryomolds | Ted Pella | 27181 | |
Iso-pentane | Sigma-Aldrich | 76871 | |
Liquid nitrogen | n/a | n/a | Use local supplier |
NWR213 Laser Ablation system | ESI Ltd | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
Agilent 8800 Series ICP-MS | Agilent Technologies | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
Iolite | Iolite Software | n/a | Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol |
Excel | Microsoft | n/a | |
IGOR Pro | Wave Metrics | n/a | Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm |