In Situ Detección y cuantificación de la célula de las nanopartículas de óxido de Metal usando análisis de microsonda Nuclear
Summary
Se describe un procedimiento para la detección de elementos químicos presentes in situ en células humanas, así como su cuantificación en vitro . El método es adecuado para cualquier tipo de células y es particularmente útil para los análisis químicos cuantitativos en las células siguiendo en vitro exposición de nanopartículas de óxido de metal.
Abstract
Micro-analítico técnicas basadas en la proyección de imagen de elementos químicos permiten la localización y cuantificación de la composición química a nivel celular. Ofrecen nuevas posibilidades para la caracterización de los sistemas vivos y son especialmente apropiados para detectar, localizar y cuantificar la presencia de nanopartículas de óxido de metal tanto en muestras biológicas y el medio ambiente. De hecho, estas técnicas todas necesidades relevantes en términos de sensibilidad (i) (de 1 hasta 10 μg.g-1 de masa seca), (ii) micrómetro gama resolución espacial y elemento (iii) detección. Dadas estas características, la proyección de imagen de elemento químico microhaz puede poderosamente complementar rutina técnicas de imagen tales como óptica y microscopía de fluorescencia. Este protocolo describe cómo realizar un análisis de microsonda nuclear en células cultivadas (U2OS) expuestas a las nanopartículas de dióxido de titanio. Las células deben crecer y ser expuestas directamente en un soporte de muestra especialmente diseñada en el microscopio óptico y en las etapas de análisis de microsonda nuclear. Inmersión de congelación criogénica fijación de las muestras conserva la organización celular y la distribución de elementos químicos. Análisis de microsonda nuclear simultánea (microscopía transmisión de iones, espectrometría de retrodispersión de Rutherford y partículas inducidas por emisión de rayos x) en la muestra proporciona información sobre la densidad celular, la distribución local de los elementos químicos, así como el contenido celular de nanopartículas. Hay una necesidad creciente de tales herramientas analíticas en biología, especialmente en el contexto emergente de la Nanotoxicología y la nanomedicina para que nuestra comprensión de las interacciones entre las nanopartículas y las muestras biológicas debe ser profundizado. En particular, como análisis de microsonda nuclear no requieren de nanopartículas que se etiqueten, abundancia de nanopartículas es cuantificable hasta el nivel de células individuales en una población celular, independientemente de su estado superficial.
Introduction
Homeostasis celular está determinada por el control de la absorción, asimilación y localización intracelular de diferentes oligoelementos (iones, metales, compuestos inorgánicos exógenos). Estos componentes son frecuentemente en forma de huellas, pero sin embargo pueden tener un impacto considerable en la fisiología del sistema. Así, el estudio de la Bioquímica celular en situaciones normales y patológica, destacó es un paso clave hacia una comprensión global de los mecanismos metabólicos celulares. Por lo tanto, hace necesario el desarrollo de técnicas de proyección de imagen y analíticas que permiten la investigación de abundancias químicas intracelulares, organización estructural y sus funciones metabólicas relacionadas. Muy pocos métodos son capaces de proporcionar una pieza cuantitativa en situ de la información relativa a la naturaleza en general química de una muestra. Aparte de métodos de análisis de muestras en forma masiva, análisis en situ consideran muestras biológicas en su integralidad sin perder información masiva y estructural, conservando así sus constituyentes químicos (iones y elementos traza) y proteínas. Además, como las nanociencias continúan desarrollándose, la proyección de imagen mejorada y métodos analíticos para la vigilancia del medio ambiente a escala celular será necesarios observar y cuantificar las interacciones y los comportamientos de nano-objeto. 1
Nanopartículas (NPs) han sido definidas como objetos de exhibir al menos una dimensión facial en el rango 1 y 100 nm. 2 debido a sus propiedades fisicoquímicas particulares, NPs son ampliamente utilizados en la industria. NPs se emplean en aplicaciones de bio y en nanomedicina. 3 , 4 a pesar de las numerosas características físico-químicas del NPs, que pueden generar riesgos de efectos adversos sobre la salud humana y el medio ambiente. Estos riesgos pueden ser inducidos por la exposición prolongada y repetitiva en varios niveles de concentración y esto no todavía se ha establecido claramente. 5 , 6 , 7 , 8 en particular, el destino de NPs dentro de las células y las respuestas celulares asociadas son, hasta la fecha, no se describe. Esto es en parte debido a la escasez de métodos que permiten la detección y cuantificación de NPs interiorizados en una sola celda. 9
Las herramientas analíticas clásicas utilizadas para estimar la dosis celular de nanopartículas son Microscopias, espectrometría de masas (MS), acoplado inductivamente a plasma MS (ICP-MS)10,11 y cromatografía líquida de que MS (LC-MS), pero sólo proporcionan información útil en la escala macroscópica. Ninguno de ellos puede proporcionar una evaluación precisa de los contenidos subcelulares de NPs ni la distribución de NPs sin el uso de métodos de fraccionamiento. Una evaluación sistemática de la dosis-respuesta por lo tanto es imposible con estos métodos, en comparación con métodos basados en la espectroscopia atómica como la microsonda nuclear análisis12,13, microscopía de fluorescencia de rayos x de sincrotrón14 y Spectrometry total de Ion secundario (SIMS). 15 , 16 estos métodos son particularmente interesantes como complemento de observaciones mediante microscopía de fluorescencia, sobre todo cuando NPs no pueden ser etiquetados con moléculas fluorescentes y así se estudiaron en su estado nativo. Hasta cierto punto, incluso cuando los NPs son injertados con fluoróforos, i cuantificación sigue siendo difícil porque se desconoce el nivel marcado por NP y (ii) la modificación química de la superficie de la NP puede modificar su distribución celular.
En este artículo, nos centramos en un método basado en una combinación de técnicas de microsonda nuclear con el objetivo de la morfología y composición elemental de muestras biológicas en mayor, menor, la proyección de imagen y seguimiento de las concentraciones.
Análisis de microsonda nuclear resulta particularmente adecuado para la medición de elementos químicos en los tejidos biológicos. La resolución lateral del haz (0.3 a 1 μm) y la sensibilidad en la detección de elementos químicos (de 1 a 10 μg.g-1 masa en seco) son ideales para estudios a nivel celular. Microsonda nuclear técnicas se basan en la detección de partículas (fotones, electrones, iones) emitida después de la viga de ion (típicamente funcionando a energías de MeV) interactúa con los átomos presentes en la muestra. Las interacciones que ocurren en las células son principalmente: 1) excitación/ionización de átomos seguido por una emisión de fotones después de átomos vuelven a su estado fundamental; y 2) difusión de las partículas entrantes hacia el cambio en su energía y dirección. La medida de la identificación de permita de energía emite partículas de átomos involucrados en la interacción. Para realizar el mapeo de elementos, el ion microhaz es repetidamente analizado sobre la superficie de la muestra, a menudo sobre un área de cerca de 100 por 100 μm2 que contiene varias células. Se detectan las partículas emitidas y su energía se registra para cada posición de la viga. Clasificación de partículas según la posición de la viga, identificando así la estructura responsable de la emisión de dichas partículas es el objetivo del tratamiento de datos. Aquí, describimos precisamente un enfoque basado en la microscopía de fluorescencia y análisis de microsonda nuclear para detectar como para cuantificar NPs exógenas en las escalas celulares y subcelular, con el fin de investigar las consecuencias de las interacciones NP con vida sistemas. Enfocará particularmente en las oportunidades ofrecidas por este método en términos de cuantificación en situ de dióxido de titanio nanopartículas (TiO2 NPs) agregados a nivel subcelular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un método que proporciona información útil más allá de lo que es posible con otras técnicas de imagen, especialmente en el nivel subcelular. Además de su capacidad de proyección de imagen, análisis de microsonda nuclear también ofrece posibilidades de cuantificación de elementos químicos en la composición de una muestra biológica. En el presente trabajo, estudiamos las poblaciones de células humanas y enfocado hacia el análisis de una región solicitada de interés basándose en una sola celda…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Serge Borderes para dirección y edición del vídeo. La Agencia Nacional de investigación francés apoya el programa de investigación TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). El CNRS y la Comunidad Europea como una actividad de integración proporcionan el “apoyo de público y Industrial investigación usando Ion viga tecnología (espíritu)” bajo la CE contrato n ° 227012. Este trabajo ha sido apoyado por acciones Marie Curie – redes de formación inicial (ITN) como una “integración actividad apoyo postgrado con prácticas en industria y formación excelencia en la investigación” (SPRITE, D1.3) bajo contrato CE nº 317169. C’NANO Grand Sud Ouest y la región Aquitania apoyan el programa de investigación TOX-NANO (n ° 20111201003) y el programa de investigación POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
Riferimenti
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