本协议描述印迹和免疫细胞化学以抑制溶酶体酶的组合如何西方可以用来演示睫状神经营养因子受体α(CNTFRα),它是由细胞因子样因子1(CLF-1之间的相互作用输送的下调)和内吞受体sorLA。
异二聚体细胞因子心脏营养素状细胞因子:细胞因子样因子1(CLC:CLF-1)靶向糖基(GPI)锚定CNTFRα以形成随后募集糖蛋白130 /白血病抑制因子受体β三聚体复合物(gp130的/ LIFRβ),用于信令。无论CLC和CNTFRα所必需的信号,但到目前为止CLF-1只被称为CLC分泌假定推动者。但是,最近已表明,CLF-1包含三个结合位点:一个用于CLC;一个用于CNTFRα(可以促进三聚体复合物的装配);和一个用于内吞受体sorLA。后者的网站为高亲和性CLF-1,CLC的结合:CLF-1,以及三聚体(CLC:CLF-1:CNTFRα)复杂sorLA,并在sorLA表达细胞的可溶性配体CLF-1和CLC :CLF-1迅速吸收并内化。在细胞共表达CNTFRα和sorLA,CNTFRα第一结合分类号:CLF-1上,形成膜相关的三聚体复合物,但它也可以通过在CLF-1的自由sorLA结合位点连接到sorLA。其结果,CNTFRα,具有用于在其自己的内吞没有容量,沿着拽和由CLC的sorLA介导的细胞内吞作用内在化:CLF-1。
本协议描述用来演示i)本sorLA介和CLC实验过程:表面膜CNTFRα表达CLF-1相关的下调; II)sorLA介导的内吞作用和溶酶体CNTFRα的目标;以及iii)CLC降低的细胞反应:在CNTFRα的sorLA介导的下调CLF-1刺激。
在CLC和CLF-1构成异源二聚体细胞因子CLC的两个亚基:CLF-1 1-3用于蜂窝信号感应,CLC:CLF-1的第一目标的CNTFRα,其初级和GPI锚定受体,以形成膜结合三聚体复合物。在CLC:CLF-1:CNTFRα复杂随后招募的gp130 /LIFRβ介导的跨膜通过JAK激酶/信号传感器和转录3(JAK / STAT3)途径4的信号活化剂。小鼠中的任何三个亚基的缺陷显示一个和相同的表型和出生后24小时内死亡,由于面部神经元和乳不足5-8的数量减少。在人类发现同样强调了三个亚基的功能一致性。因此,人类突变(纯合子或化合物)CLC的引起功能障碍:CLF-1或CNTFRα,所有结果在所谓的冷诱导的出汗/ Crisponi综合征,其特征在于症状例如impai一个条件红乳和吞咽,各种畸形特征,温度峰值,和似是而非,灌注低温出汗9-11。
在体外,CLC和CNTFRα的结合是必要的和足够用于与gp130的/LIFRβ相互作用和在单元12的信号的诱导。 CLF-1的另一方面中的作用尚不清楚。它不直接参与的信号,早已被看作是主要用来方便方介绍1细胞分泌的附录。然而,最近的研究结果显示,CLF-1有更多和更重要的功能都牵涉信令和CLC和CNTFRα成交。因此,看来CLF-1含有3个独立的结合位点:一个用于它的公知的结合CLC;一个介导直接结合到CNTFRα;和第三(高亲和力)的网站与内吞受体sorLA相互作用。作为CLC和CLF-1似乎都 具有比CLC相当低亲和力靶向CNTFRα:CLF-1复合物,可以想到的是CLF-1(通过其CNTFRα结合位点)促进CLC和CNTFRα的统一,并由此促进信号13。
CLF-1与sorLA互动,本演示的主要问题,扮演着一个完全不同的角色。 SorLA是五个类型1受体构成Vps10p域受体家族14中的一个。它是在各种组织中,但特别是在脑和神经组织15表达。类似于其他家庭成员sorLA携带N末端配体结合Vps10p域,但除此之外,还包括其他的域类型,包括在所述低密度脂蛋白受体家族15成员发现配体结合的元件。其胞质尾与几个接头蛋白, 如接头蛋白-1与-2和sorLA交互传递效率endocytos是以及结合蛋白16-18的细胞内分选和运输。该Vps10p域包括大十刃β螺旋桨19,20,结合一系列不相关的配体,包括CLF-1(但值得注意的是,并非CLC)13。在CLF-1的结合位点是可访问的,即使以后形成复合物与CLC和CNTFRα这意味着sorLA不仅结合游离CLF-1,但也分类号:CLF-1和三聚体复合物CLC:CLF-1:CNTFRα13。 SorLA传达CLF-1和CLC的快速内吞:CLF-1,但这些是可溶性蛋白而CNTFRα被固定到由一个GPI锚的表膜。的问题因此,如果结合CLC的:CLF-1:CNTFRα允许sorLA内化整复,从而改变CNTFRα的面膜表达(和随后的蜂窝易感性CLC:CLF-1信号诱导)和/或CNTFRα的营业额。
在本描述的实验报告旨在阐明以下几个问题:
是否sorLA调解中图分类号:表面膜CNTFRα的CLF-1依赖性下调?为了阐明这一点,它最初试图确定CNTFRα的收入(在不存在和sorLA的存在下)通过的代谢标记和脉冲追踪实验装置如21所述。然而,试图用CNTFRα[S 35]半胱氨酸的混合物,[S 35]甲硫氨酸显示出放射性掺入差标记。这提出了一个非常低的程度的新的合成,它在所有的可能性将是无法弥补的受体的突然和显著损失。要确定是否在通过CLC互连CNTFRα下调:CLF-1 sorLA,有人因此决定之前和暴露于CLC后简单地测量(使用免疫印迹)CNTFRα总细胞池:CLF-1 – 并比较结果在细胞转染或不与染sorLA。
是否sorLA目标CNTFRα到溶酶体?要回答这个问题,CNTFRα的定位 – 通过其CLC内在:CLF-1介导结合sorLA – 利用免疫细胞化学进行了检查,并针对CNTFRα晚期内体/溶酶体标记溶酶体相关的膜蛋白1抗体和标记(LAMP-1)。该实验是在处理过的以及未经处理的同溶酶体酶的抑制剂的细胞进行。当时的想法是,当然,如果CNTFRα在溶酶体降解,用酶抑制剂处理的细胞会提出CNTFRα染色的LAMP-1阳性囊泡积累,而未经处理的细胞会显示CNTFRα很少或根本没有染色。
是否CNTFRα下调降低方介绍细胞反应:CLF-1的刺激?三聚体复合物通过使用JAK / STAT3所述的gp130 /LIFRβ异二聚体由CLC,CLF-1和CNTFRα信号途径。因此,细胞的能力,以应对分类号:在CNTFRα下调CLF-1信号通过Western印迹检测和在sorLA转染的磷酸-STAT3(pSTAT3的)/总STAT3水平的定量探讨。
这里所描述的协议可以专门用于演示sorLA介导CLC:CLF-1依赖性下调和溶酶体CNTFRα靶向,以及伴随的减弱响应于CLC:CLF-1的刺激。
在HEK293细胞系非常适合于这个协议中,因为它们具有CNTFRα和sorLA只有轻微的内源性表达,很容易就可以转染,表达的gp130 /LIFRβ,并具有大的胞体,其是适合进行免疫细胞化学。然而,在理论上具有类似特性的细胞系应正常工作。
该协议有两个关键步骤。第一个问题步骤2.3,其中列伊/ PEP介质必须更换大约每6小时24小时。如果不这样做,可能会导致积极的溶酶体酶,减少或蛋白质的溶酶体中没有检测到积累。第二个关键步骤(3.4)的关注与CLC在预孵化洗:CLF-1。这是IMportant以除去任何未结合的配体,并且以使细胞的时间来恢复(避免持续刺激)在未补充的DMEM(空白培养基)。这将确保以后的再刺激与CLC中pSTAT3的低背景水平:CLF-1(步骤3.5)。
值得注意的是, 图6表明细胞反应(pSTAT3的)与CNTFRα的sorLA介导的下调平行减小。但是,应当强调的是,虽然减少反应是按照(并且在预期)的减少的CNTFRα池的,它并不能证明低CNTFRα表达单独占降低的细胞应答。因此,变化 – 从预刺激或转染得到的 – 中的任何信号通路上游pSTAT3的的功能元件的可能的改变的响应作出了贡献。
该协议的基本概念并不限于此particuLAR受体系统。 ( 即另一个细胞系,其他抗体,其他配体, 等 )通过修改协议可以被用来确定其他受体的配体诱导的下调,以及-无论sorLA's参与。然而,应该指出的是,通过Western印迹受体下调的分析主要是适合的受体, 例如 ,GPI锚定受体,它表现出缓慢周转和在未刺激的细胞中低度的新合成的。因此,在受体表示的新合成高水平,配体诱导的下调可用于通过新的受体合成补偿。在这些情况下,该受体池的下调可以改为通过代谢标记和脉冲追踪实验装置如在21中所述测定。可替代地,不与受体干扰碘化抗体(优选的Fc片段)结合可用于“标记”的招待的胞外域或者,与预期的下调然后可以通过细胞沉淀和介质的放射性计数测定。
为物流原因我们转染我们的带CNTFRα细胞构建携带一个Myc-标签,并在本协议被用于受体的Western印迹检测的小鼠抗Myc抗体。与此相反,使用山羊抗CNTFRα抗体进行免疫细胞化学和双标记为LAMP-1是由小鼠抗体检测 – 显然使用两个初级小鼠抗体会导致与第二抗体的非特异性(重叠)染色。注意,由于山羊抗CNTFRα也适用于蛋白质印迹(未示出),该协议可以很容易地进行修改和应用到与未标记CNTFRα转染的细胞。
最后,最近已表明,还内吞受体分拣蛋白结合分类号:CLF-1以高亲和力22。因此,可以想到的是分拣蛋白,像sorLA,互连方介绍:通过CLF-1CNTFRα并能介导的内吞作用和溶酶体目标CNTFRα为好。使用分拣蛋白代替sorLA,本协议可用于澄清这个问题。
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
Saponin | Sigma | S7900-100G | |
Mounting Media | Dako | S3023 |