Bu makalede, bir glial tek tabakalı üzerinde ters cam lamelleri büyüyen düşük yoğunluklu birincil hipokampal nöronlar kültürleme için protokol açıklar. nöron ve glial tabakalar parafin mumu ile ayrılır. Bu yöntem ile yetiştirilen nöronlar yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme ve işlevsel tahliller için uygundur.
kültür içinde tek tek sinir hücrelerinin yapısı ve fizyolojisi sonda yeteneği nörobiyolojisinin çalışma için çok önemlidir, ve tek tek hücreler veya tanımlanmış ağlar genetik ve kimyasal manipülasyonu esnekliğe olanak sağlamaktadır. sağlam beyin doku ile karşılaştırıldığında manipülasyon gibi kolaylığı düşük kültür sisteminde daha basittir. Bu birincil nöronların izolasyonu ve büyümesi için birçok yöntemler varsa da, her biri kendi sınırlamaları vardır. Bu protokol daha sonra glial hücrelerin tek bir tabakası üzerinde asılı duran cam lameller, düşük yoğunluklu ve yüksek saflıkta kemirgen embriyonik hippokampal nöronlar yetiştirmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bu 'sandviç kültürü' altta yatan glial tek tabaka trofik destek için izin verirken nöronların nüfusu münhasır uzun vadeli büyüme için izin verir. nöronlar yeterli yaş ve olgunluk seviyesi olduğunda, nöron lamelleri glial çanak Çıkış ters çevrilmekte ve görüntüleme ya da işlevsel tahlillerde kullanılabilir. Nöronlar gBu yöntemle rown genellikle birkaç hafta boyunca hayatta ve kapsamlı milleri, sinaptik bağlantıları ve ağ özelliklerini geliştirir.
Beyin nöronların karmaşık ağlar halinde düzenlenmiştir. ağ etkinliği ve beyin fonksiyonu için bireysel nöronların katkı molekül bileşimi ve bunların fizyolojik özelliklerinin perturbance seçici değiştirilmesi ile incelenebilir. bireysel nöronların genetik ve kimyasal işleme sonrakinin hücresel heterojenlik ve karmaşıklığı ile serbest, sağlam beyin dokusunda daha kültüre edilmiş nöronlarda muhtemelen daha kolaydır. kültürde Nöronlar iyi tanımlanmış aksonal ve dendritik milleri geliştirmek ve birbirleriyle kapsamlı sinaptik bağlantıları oluşturur.
Yetişkin hayvanların veya sinir sisteminin diğer bölgelerden nöron kültürü mümkün olsa da, embriyonik hippokampal kültürler sık sık tarif piramidal hücre popülasyonu ve nispeten düşük glial yoğunluğu 1, 2 nedeniyle tercih edilir. kültürde düşük yoğunlukta yetiştirilir hipokampal nöronlar bilhassa ame olanalt hücresel lokalizasyonu, protein değiş tokuşunu, nöronal polarite ve sinaps gelişimini çalışmaya nable. Kültür nöronlar da kapsamlı sinaptik plastisite 3, 4, 5, 6, moleküler süreçler üzerinde çalışılması olarak kullanılmıştır. Doğum sonrası hayatta olmayan küresel genetik delesyonu olan farelerden alınan Nöron kültürü hazırlıkları belli genlerin 7 hücresel ve sinaptik roller okuyan özellikle yararlıdır olmuştur.
Beyinde gibi, kültürlenmiş hipokampal nöronlar glial hücrelerden trofik desteğine bağlıdır. Bu kendi kültür zorlaştırmaktadır ve bu destek verilir hangi birkaç farklı yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Yaygın olarak kullanılan bir yöntem, glial hücreler 8 ya da edinilmiş Hipp kirletici glial hücreler sağlayan bir tek tabaka üzerine direkt olarak nöronlar kaplama içerirocampal doku çoğalır ve nöronlar 9 altında bir tek katman oluşturmak için. Bu yöntem bazı başarılar sağlamasına rağmen, ortaya çıkan nöronal kültürün kirlilik görüntüleme deneyleri için sakıncalıdır. Nöron kültürü Bir başka sık kullanılan yöntem, tamamen tabaka glial besleyici Çıkış bırakın ve bunun yerine belirli bir büyüme ortamında 10 şeklinde trofik destek sağlamaktır.
Burada, "sandviç" ya da nöron kültürü 2, 11 "Banker" yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, daha sonra parafin mumu ile ayrılmış, glial hücrelerin tek bir tabakası üzerinde asılı duran cam lameller üzerinde hipokampal nöronlar kaplama içerir. Bu altta yatan glial tek tabaka trofik destek için izin verirken glia kirletmeden nöronların homojen nüfusun uzun vadeli kültürü kolaylaştırır. Nöronlar yeterli yaş ve olgunluk düzeyine ait olduğunda,nöron lamelleri-çevrilmiş üzerinden glial çanak ve görüntüleme ya da işlevsel tahlillerde kullanılabilir.
Kültürleme nöronların "sandviç" yöntemi başka yerlerde iyi anlatılmış olmasına rağmen 2, 11, bunu kabul etmek isteyen araştırmacılar için hayal kırıklığı yol açabilir sadece metin olarak tarif etmek oldukça zordur protokol boyunca çeşitli adımlar vardır.
Glial kültür, lamel hazırlanması ve nöron kültürü ve bakım: yöntem, üç ana iş akışları ayrılabilir. Üç hazırlıkları Her ak?…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma CIHR MOP-142209 TJs için destek verdi.
Dissection Instruments | |||
Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Preparation | |||
Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Culture | |||
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Coverslip Preparation | |||
Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Miscellaneous | |||
Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |