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Biologia dello sviluppo

Kultur von murinen embryonalen Mittelfuß: ein physiologisches Modell der enchondralen Verknöcherung

Published: December 03, 2016
doi:
10.3791/54978
, , ,
1Developmental Biology, The Roslin Institute and R(D)SVS,The University of Edinburgh

Summary

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Abstract

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

Introduction

Das Skelett ist ein sehr komplizierten, dynamischen und komplexen Organ, das eine Reihe von Funktionen die sich vom Fortbewegung hat, zu Ionenhomöostase. Bestehend aus Knochen und Knorpel, besteht das Skelett funktionell unterschiedlichen Zellpopulationen , die es strukturellen, biochemischen und mechanischen Integrität aufrechtzuerhalten betreiben 1. Eine der primären Funktionen des Skeletts ist seine Rolle bei der Entwicklung und Wachstum. Diese Prozesse erfordern die Orchestrierung von mehreren Zellpopulationen, die durch enge endokrinen und genetischen Kontrolle geregelt werden.

Mit Ausnahme der flachen Knochen zB Schulterblatt, Schädel und Brustbeins wird das Säugetier-Skelett durch den Prozess gebildet , wie endochondral Verknöcherung bekannt. Dieser Prozess, der reguliert sowohl molekular als auch räumlich, beginnt mit der Kondensation von mesenchymalen Zellen 2 in erster Linie aus dem Mesoderm abgeleitet. Unter dem Einfluss des Transkriptionsfaktors SOX9, Zellen in the Innere der Kondensationen Differenzierung zu Chondrozyten exprimiert und Knorpel spezifische extrazelluläre Matrix (ECM) -Komponenten wie Typ-II-Collagen und Aggrecan-sezerniere. Die Zellen am Rand der Kondensation ausdrücken Typ I die Perichondriums Kollagen und bilden, die potenzielle Knochen Abgrenzen 3. Später, differenzieren sich die osteoprogenitors des Perichondrium in Osteoblasten, durch die Expression der Transkriptionsfaktoren gerichtet sind , und Runx2 osterix 4. Dies führt zu einer Dominanz von Osteoblasten und diese Schicht wird das Periost umbenannt, die um den mittleren Bereich des Knochens eine mineralisierte Knochen Kragen bildet. Vascular Eindringen der Knochenhaut und Invasion des knorpeligen Gerüsts auftritt und mit ihm, haematopoetically abgeleitet Knochen resorbierenden Zellen, die Osteoklasten, die die Chondrozyten – Reste und ein großer Teil der knorpeligen Matrix 5 resorbieren. Die Zwischenräume gebildet sind durch osteoprogenitors, die zu den primären Ossifikation gefülltZentrum, das schrittweise den Kern der Diaphyse einnimmt und verschmilzt mit dem Periost. Andere Zellen führen zu Knochenmark. Rund um Geburt, Blutgefäße und osteoprogenitors dringen in die Knorpel reichen Matrix an beiden Seiten (Epiphyse) der Entwicklungs Diaphyse des sekundären Ossifikation Zentrum zu bilden. Zwischen der Epiphyse und Diaphyse an beiden Enden der langen Röhrenknochen ist eine Band von Knorpel – die epiphysären Wachstumszone – die für die Koordination der linearen Wachstum aller langen Knochen 6 verantwortlich ist.

Chondrozyten innerhalb der Wachstumszone zunächst vermehren und anschließend durch morphologisch unterschiedliche Zonen Fortschritt, durch sequentielle Expression von Transkriptions und Wachstumsfaktoren koordiniert. Das Ergebnis dieser Sequenz von Ereignissen ist der Ausgang aus dem Zellzyklus und Hypertrophie von Chondrozyten in der Mitte dieser Knorpelvorläufer. Hypertrophe Chondrozyten stark Typ X Kollagen und Matrix-Metalloproteinase auszudrücken13 (MMP13) und deren erhebliche Volumenvergrößerung in Richtung des Längenwachstums bietet auf das Knochenwachstum bei Säugetieren 7,8 den größten Beitrag. Weiterhin spezialisiert hypertrophen Chondrozyten mineralisieren der sie umgebenden ECM durch die Freisetzung von Matrixvesikel, Membran begrenzt Strukturen für die Herstellung von amorphem Calciumphosphat durch ihre Aufnahme von Phosphatasen (tissue unspezifischen alkalischer Phosphatase (TNAP) und PHOSPHO1) und Calciumkanalbildung Proteine ​​(Annexine ) 11.09. Dieser verkalkte Knorpel wird durch die Blutgefäße aus dem darunter liegenden Knochenmark, was zu Osteoklasten Rekrutierung und Matrix Resorption eingedrungen. Dies wird durch die Osteoblasten-Migration und die Ausrichtung auf die Oberfläche der verkalkte Knorpelreste gefolgt, wo sie eine Schicht von Osteoid festzulegen, die schnell mineralisiert ist. Das gewebte Knochen des primären Spongiosa wird später zu Lamellenknochen des sekundären Spongiosa 12 umgebaut. Epiphysäre Fusion Ergebnisse in derEinstellung der enchondralen Verknöcherung 13.

Endochondrale Verknöcherung ist unter strengen Regulierung von vielen endokrinen und parakrinen Hormone und Wachstumsfaktoren , so wie gestörter Entwicklung und / oder longitudinale Knochenwachstum 14 zu verhindern. Ein besseres Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegt, ist daher zwingend notwendig, in unserem Streben nach klinische Fortschritte in Richtung Nutzen für den Menschen. Bisherige Untersuchungen in die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Wachstumsplatten von unterschiedlichen Alters, Standorte und Arten haben unser Verständnis der physiologischen Mechanismen umgebenden Wachstumsfuge Dynamik 15,16 stark verbessert. Allerdings ist die Untersuchung von isolierten Chondrozyten schwierig, da die Entfernung von Chondrozyten aus ihrer Umgebung zu Dedifferenzierung führen kann, begleitet von einem Verlust der Expression von Schlüsselmarkern wie COL2A1 17.

Die Maus Metatarsalorgan Explantation Kultur, pioneered von Prof. Elisabeth Burger und Kollegen in den Niederlanden, ist ein hoch physiologischen ex vivo Modell für die Untersuchung der enchondralen Verknöcherung und Knochenwachstum als die Wachstumsrate der Knochen in Kultur zu imitieren , dass 18 in vivo gesehen. Einzigartig ist , ermöglicht es dem Mittelfußorgankultur , die Prüfung von Chondrozyten in verschiedenen Phasen der Chondrogenese und hält Zell-Zell- und Zell-Matrix – Interaktionen, also Bedingungen näher an der in vivo Situation als Zellen in Kultur 19-21 bereitstellt. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell für die direkte Untersuchung von linearen Knochenwachstum, die nicht möglich, in primären Chondrozytenkulturen ist. Es ermöglicht auch die Abtrennung von systemischen und lokalen Faktoren daher die spezifische Analyse der lokalen Auswirkungen auf die Wachstumsplatte ermöglicht.

Die Kultur der Metatarsalknochen ermöglicht die Untersuchung von zahlreichen Parametern. Tägliche Messungen der Gesamtlänge und der mineralisierten BereicheRudimente können mit Standard-Phasenkontrast-Mikroskopie und Bildanalyse-Software durchgeführt werden. Histologische, in situ Hybridisierung und immunhistologische Färbung kann leicht auf Mittelfußabschnitte durchgeführt werden, die für die räumliche Auflösung beider zellulären und molekularen Entitäten ermöglicht, einen großen Vorteil gegenüber traditionellen Zellkulturverfahren. Die immunhistochemische Ansatz beinhaltet die Detektion und Quantifizierung von 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) -Aufnahme um 22 Chondrozyten proliferierenden. Zusätzlich kann die weitere Verarbeitung der Mittelfuß Geweben durchgeführt werden, für die nachfolgende Analyse der mRNA-Expression (RT-qPCR), Protein und intrazelluläre Signalanalyse (Western-Blot) oder Lipidzusammensetzung (Massenspektrometrie) zu ermöglichen. Die meisten Studien bisher verwenden kultivierten embryonalen metatarsals statt metatarsals von postnatalen Tieren. Während beide Modelle informativ sein kann, hat die Untersuchung der embryonalen Knochen mehrere Vorteile: sie schneller wachsen und Explo sein kanngrenzte die Initiierung und Progression des Mineralisierungsprozess 23-25 zu studieren.

Dieses Protokoll beschreibt ausführlich die komplizierte Präparation von embryonalen Mittelfuß aus dem Hinterbein von embryonalen Tag 15 (E15) murinen Embryonen. Darüber hinaus wird das Wachstum und die Mineralisierung von anatomisch verschiedene Metatarsalknochen gezeigt.

Protocol

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden in Übereinstimmung mit den britischen Animals (Scientific Procedures) Act 1986 und die Tiere wurden gehalten in Übereinstimmung mit dem Innenministerium veröffentlicht Code of Practice für die Unterbringung und Pflege von gezüchteten, Lieferung oder für wissenschaftliche Zwecke eingesetzt durchgeführt. HINWEIS: Die Versuche Wildtyp C57BL / 6J-Mäusen durchgeführt sind gut etabliert und weiter unten beschrieben. Embryonale metatarsals aus verschiedenen Mausstämme können in ähnlicher Weise in vitro kultiviert werden, obwohl ihr Wachstum und Mineralisierungsraten denen die hierin angegebenen abweichen können. 1. Dissection Bedingungen und Aufbereitung von Instrumenten Führen Sie alle Medienherstellung, Gewebe Dissektionen und Kulturarbeit in einer Laminarströmungsabzug die Sterilität der Medien und der embryonalen Rudimente zu gewährleisten. Erlauben Kultur und Dissektion Medien für mindestens 1 Stunde in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator vor der Verwendung äquilibriert. Sterilisieren DissektionSchere, Dumont # 5 und Dumont # 4 Pinzette neben einem Paar superfeinen Vannas Mikro Schere (8 cm gerade, 3 mm Klingen) durch Autoklavieren. Nach dem Autoklavieren, tauchen zu verwenden, um die Dissektion Ausrüstung in 70% Ethanol vor. 2. Herstellung von Dissection und Kultur Medien Bereiten Sie Dissektion Medium Verdünnte α-Minimum Essential Medium (ohne Nukleoside, & agr; MEM) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (1,13) und resuspendieren Rinderserumalbumin (BSA) bei 2 mg / m l vor Filter Sterilisieren durch ein 0,22 & mgr; m, 33 mm Durchmesser syringe Filter. HINWEIS: Dissection Medium kann auf unbestimmte Zeit bei -20 ° C in Aliquots hergestellt, Filter-sterilisiert und gelagert werden. Bereiten Kulturmedium Kultur embryonaler Mittelfuß in 300 ul Kulturmedium (in jeder Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte). Vorbereitung des Kulturmediums 0,2% w / v BSA Zugabe; 5 ug / ml L-ASCOrbic sauren Phosphat; 1 mM β-Glycerophosphat (βGP; optional – siehe Abschnitt Ergebnisse); 0,05 mg / ml Gentamicin und 1,25 & mgr; g Amphotericin B zu & agr; MEM und Filter durch einen Filter mit 0,22 & mgr; m, 33 mm Durchmesser Spritze sterilisieren. 3. murine embryonale Mittelfuß Dissection und Kultur Cull die schwangere Maus, 15 Tage alten Embryonen, durch Genickbruch in Übereinstimmung mit Home-Office-Richtlinien im Vereinigten Königreich Beherbergung Legen Sie das Tier dem Rücken und zu desinfizieren die Haut, indem sie mit 70% Ethanol gesprüht wird. Verwendung Dissektion Schere machen einen großen Einschnitt in der Mittellinie, sowohl die Haut durchdringt und das Peritoneum in die Bauchhöhle zu exponieren. Suchen Sie die beiden Uterushörner des Tieres im dorsalen Bereich des Körperhohlraums. Entfernen Sie die Gebärmutterhörner, indem zunächst jede uterine vom Mesometrium durch sorgfältige Schnitte mit Dissektion Schere zu befreien und dann schließlich das Schneiden der Gebärmutterhörner frei an ihrer Basis. Place Uterushörner in Dissektion Medium. Trennen Sie die Embryo durch entlang der Uterushorn zwischen Implantationsstellen schneiden und entfernen Sie die Embryonen aus ihren einzelnen Säcke Pinzette. Cull Embryonen durch Enthauptung in Übereinstimmung mit Home-Office-Richtlinien im Vereinigten Königreich Nach Desinfektion der Haut mit 70% Ethanol durch Sprühen, verwenden Vannas Mikroscheren, die Hinterbeine von den Embryonen zu entfernen, indem um den proximalen Femur Einschneiden. Dies gewährleistet, so viel von der Hintergliedmaße wie möglich entfernt wird. Legen Sie die Hinterbeine in eine Petrischale in Dissektion Medium vor der Mittelfuß Dissektion untergetaucht. Unter einem Binokular, beginnen die Haut rund um die embryonale Fuß zu entfernen, durch Kneifen und ihn zunächst mit der # 5 Pinzette während Halten der hinteren Gliedmaßen stetig mit Hilfe der # 4 Pinzette ziehen. Dies wird am effektivsten durch Greifen der Haut durchgeführt, um etwa auf dem Niveau der Tibia und ziehen in Richtung der Phalangen. Der Einsatz von Schere in diesem Stadium zu schneiden Sie diesehr dünne Haut ist nicht erforderlich. Halten Sie sorgfältig die tarsals des embryonalen Fuß mit # 4 Pinzette und entfernen Sie die ersten und fünften Mittelfußknochen durch in der Nähe der Fußwurzel mit # 5 Pinzette Abschnüren und entsorgen. Mit dem Fuß in der gleichen Position gehalten, verwenden Sie die # 5 Pinzette das Bindegewebe zwischen den drei verbleibenden phalanges und metatarsals zu stören. Führen Sie die Spitze # 5 Pinzette an der Verbindung zwischen den Phalangen und Mittelfuß, um die Phalanx aus den Mittelfußknochen entfernen. Schließlich verwenden # 5 Pinzette das Bindegewebe zwischen den tarsals und Mittelfuß zu stören. legen Sie wieder die Spitze # 5 Pinzette in den Gelenkraum zwischen den tarsals und Mittelfuß und den Mittelfuß sanft frei von den tarsals. holen Sie vorsichtig die jetzt frei metatarsals mit # 4 Pinzette und in frischem Dissektion Medium. HINWEIS: Eine sorgfältige Präparation 6 metatarsals von jedem Embryo zur Verfügung stellen sollte. Wenn alle erforderlichen metatarsals seziert haben worden, carefully Ort metatarsals einzeln in die vorgewärmte 24-Well-Platten, die 300 & mgr; l Kulturmedien. Kultur Metatarsalknochen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator für bis zu 14 Tage. HINWEIS: Ändern Sie nicht die Medien von E15 Kulturen bis mindestens Tag 5 der Kultur , da dies negative Auswirkungen auf ihre Mineralisierung Fähigkeit 26. Die Gründe dafür sind unklar, aber das Längenwachstum und Matrixmineralisation können aus den Metatarsalen freigesetzt nach Stimulierung durch Wachstumsfaktoren abhängig. 4. Analyse und Manipulation von Mittelfuß Kulturen Am Tag der Dissektion (Tag 0) machen anfänglichen Längs Messungen mit einem Mikroskop mit einer Digitalkamera angebracht und Bildanalyse-Software. Messen der Länge des zentralen Mineralisierungszone, wenn es nach einigen Tagen Kultur erscheint. Von Zeit zu Zeit, je nach Bedarf, stellen weitere Messungen ( in der Regel jeden 2. Tag) bis zum letzten Tag der Kultur , an welcher Stelle metatarsal Knochen sind abhängig von erforderlichen Ergebnisse verarbeitet werden (in der Einleitung beschrieben). Supplement Medium Mittelfußorgankulturen mit verschiedenen exogenen Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Hormone und pharmakologische Mittel von Tag 0 der Kultur 22,24. In allen Studien dieser Art Kontrolle unbehandelt Metatarsalknochen erforderlich sind. Hinweis: Obwohl es ratsam ist , dass die Steuer Knochen das Äquivalent Rudiment aus dem kontralateralen Bein sind, gab es keine Unterschiede wurden in ein lineares Wachstum oder Mineralisierung Potenzial von kultivierten E15 2., 3. und 4. Metatarsalknochen (siehe unten, Abbildung 2) .

Representative Results

Das Ziel dieses Verfahrens war die embryonale Metatarsalknochen und Kultur sie zur Prüfung von Längsknochenwachstum und ECM Mineralisation isolieren. Mit unserem Protokoll hier beschrieben wurden embryonale Mittelfußknochen erfolgreich seziert, wie durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht. Messungen der Mittelfußknochen, 1 durchgeführt , wie angegeben in Fig zeigten ihre Fähigkeit in Längslänge zu wachsen und mineralisieren ihre ECM (2 und 3). Mineralisation der Matrix wird zuerst in der Mitte der Diaphyse des Knochens Rudiment festgestellt und wird leicht durch Lichtmikroskopie beobachtet. Keine Färbung ist erforderlich, obwohl die Aufnahme von Calcein verbesserte Visualisierung der neu gebildeten Mineral bieten kann. Studien embryonale metatarsals bisher 22,27,28 Verwendung des seziert 2. haben gepoolt, 3. und 4. (centrale drei) Metatarsalknochen, vergleichbar zu sein in vitro Wachstum und Mineralisierung vorausgesetzt. In vivo Entwicklung von murinen Metatarsalknochen zeigt jedoch, dass die 3. und 4. Ziffern Nachweis der Mineralisierung 29 vor allen anderen Metatarsalen und Phalangen haben. Bewertung des Wachstums und der Mineralisierung Potential einzeln isoliert und kultiviert E15 2., 3. und 4. Metatarsalknochen ergab keine signifikanten Unterschiede in dem Auftreten oder das Ausmaß der Mineralisation nach 7 Tagen Kultur (Abbildung 2). Kein Unterschied in der prozentualen Anstieg vom Ausgangswert wurde während der Kulturperiode gefunden. Da keine Unterschiede in der Mineralisierung Potenzial das Standardprotokoll der Bündelung der 2. 3. und 4. Metatarsalknochen wurde festgestellt erscheint für zukünftige Studien gültig. Herkömmlicherweise haben Forscher hinzugefügt βGP Medienzur Kultur embryonaler Mittelfuß verwendet ECM-Mineralisierung zu fördern. In Zellkulturstudien wurde gefunden , daß jedoch gezeigt, wenn TNAP Enzym osteogenen enthaltenden Medien βGP, ectopic Hydroxyapatit Mineralabscheidung noch in Abwesenheit von Zellen auftritt , sogar 30 hinzugefügt wird. Um die Auswirkungen der verschiedenen Mineralisierungs Substrate und Agonisten auf Mittelfuß Mineralisierung Fähigkeit zu untersuchen, wir kultiviert E15 metatarsals in Kulturmedien eine Reihe von Ergänzungen enthalten, und Bilder und Längenmessungen wurden täglich aufgezeichnet. Ergebnisse zeigten, dass E15 Metatarsalknochen noch ihre ECM in Abwesenheit von βGP wachsen und mineralisieren. E15 Mittelfußknochen kultiviert in Ascorbinsäure nur Medien zeigten eine vergleichbare Zunahme der Länge und Mineralisierung als metatarsals in Gegenwart von βGP (Abbildung 3) kultiviert. Wir haben auch gezeigt, dass Lentiviren können verwendet werden exogene DNA in kultivierte metata zu transfizierenrsals. Hier wir Metatarsalknochen am Tag 0 der Kultur (dh Tag dissection) mit 2 x 10 & sup6 ; green fluorescent protein (GFP) , Viruspartikel pro Mittelfuß erfolgreich transfiziert. Um Virusübertragung zu ermöglichen, wurde Polybren gleichzeitig zu Kulturen bei 1: 500. Die Kulturen wurden für 7 Tage gelassen, ohne Medienwechsel wie für E15 Mittelfuß Mineralisation erforderlich auftreten, bevor mit 4 'inkubiert werden, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) stain für 5 min und dann direkt visualisiert ein konfokales Mikroskop ( Abbildung 4). Unsere Proof of Concept Experimente zeigen deutlich, wirksam Übertragung. Jedoch wäre es klug, Abschnitte über die Gesamtheit des Mittelfußknochens zu untersuchen ihre Transfektionseffizienz und wirksame Genmanipulation zu bewerten. Abbildung 1: Standard Methodik t Maßnahmeer Länge und Mineralisation Zone embryonaler Mittelfuß. (A) Gesamtlänge Messungen E15 Metatarsalknochen am Tag 0 der Kultur (Tag dissection) durch die Mitte des Mittelfuß genommen. (B) Messungen der longitudinalen Gesamtlänge eines Mittelfuß nach sieben Tagen in Kultur. Man beachte die leichte Krümmung im Mittelfuß. (C) Messung der Länge Mineralisierung Zone nach sieben Tagen in der Kultur. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Wachstum und Mineralisation Kapazität von Anatomisch Distinct E15 Mittelfuß Imaging und die Messung der 2., 3. und 4. Mittelfuß aus dem Hinterbein von E15 – Mäusen w.wie ausgeführt. (A) Serielle Bilder des 2., 3. und 4. Metatarsalknochen in der gesamten Kulturperiode. (B) Prozentuale Zunahme der Länge von Tag 0 an jedem Tag der Kultur. (C) Mineral Länge der 2., 3. und 4. Metatarsalknochen über die Kulturdauer , ausgedrückt als Prozentsatz des gesamten Mittelfußlänge. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt wird, (n = 6). (D) C57Bl / 6J Mittelfußlängen an jedem Tag der Kultur. Die Daten in sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt (n = 6). Schwarz bar = 1 mm. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Wachstum und Mineralisation Kapazität von Wild-TypE15 Mittelfuß Cultured in verschiedenen Osteogenisches Medien. (A) Serienbilder von metatarsals kultiviert in Ascorbinsäure nur, 1 mM βGP, 3 mM phosphocholin, 1,5 mM Calciumchlorid oder 3 mM Calciumchlorid enthaltenden Medien. (B) Prozentuale Zunahme der Länge von Tag 0 von metatarsals kultiviert mit den verschiedenen Beilagen. (C) Minerallänge Metatarsalknochen kultiviert in unterschiedlichen Medien ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtlänge Mittelfuß. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt wird, (n = 6). Schwarz bar = 1 mm. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Transfektion von E15 Mittelfuß mit GFP – Virus PArtikel. (A) E15 Mittelfußknochen wurden mit GFP – Viruspartikel für Proof of Concept transfiziert. (B) Knochen wurden mit DAPI für die DNA – Visualisierung gefärbt. (C) Zwei Bilder angezeigt erfolgreiche Transfektion von GFP – Virus über die Gesamtheit der Mittelfußknochen. Weiße Balken = 0,5 mm. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die Kultur des murinen embryonalen metatarsals bietet eine hoch physiologischen Modell von endochondral Wachstum und Mineralisierung. Frühe Studien haben bestätigt, dass E15 Maus metatarsals ein normales Muster der Skelett-Wachstum und die Differenzierung unterzogen werden. Der Knorpel (Chondrozyten) und Knochen (Osteoblasten und Osteoklasten) Zellen und ihre jeweiligen Kollagenmatrizen sind nicht von denen in vivo beobachtet. Allerdings gibt es einige anerkannte Grenzen dieses Modells. Die Geschwindigkeit der Differenzierung von Osteoklasten beeinträchtigt ist, wie das Knochenwachstum ist (aber die Differenzierung nicht Knorpel). Knochenwachstum beträgt etwa 50% langsamer ist als die in vivo beobachtet und kann aufgrund von Mängeln in systemischer Faktoren, die die Produktion von lokalen Faktoren beeinflussen (beispielsweise IGF-1, BMPs, etc.) 31. Auch ist es allgemein bekannt, dass Knochen seiner mechanischen Umgebung empfindlich ist, und dies ist auch der Fall für kultivierte Metatarsalknochen, die c antwortenHanges in mechanischer Belastung 32,33. Daher wird in unbelastetem Situationen, wie in diesem Protokoll, Mineralisierung und Mineral Resorption beschrieben kann beeinträchtigt werden. Dennoch bietet die Mittelfuß Modell die Möglichkeit , lineare Knochenwachstum direkt zu messen , die über 2D- und 3D – di – vitro – Kultursystemen nicht möglich ist.

Wir haben eine umfassende Beschreibung des Protokolls in der Präparation und Kultur von E15 Maus Mittelfuß und in der Tat zum ersten Mal beteiligt vorgesehen ist , bestätigen die Gültigkeit der Bündelung der 2., 3. und 4. Metatarsalknochen für Experimente.

Metatarsalknochen von E17 / E18 werden üblicherweise zur Untersuchung der Mechanismen des Knochenwachstums aufgrund ihrer außerordentlichen Potenzial zu wachsen ex vivo für längere Zeiträume (dh über 14 Tage in Kultur) verwendet. Sie sind ein gut etabliertes Modell, um die Rolle von Wachstumsfaktoren auf die embryonale Längsknochenwachstum zu untersuchen.Zusätzlich wird die Dissektion und die Kultur von postnatalen Metatarsalknochen allgemein die Mechanismen umgebenden postnatale Knochenwachstum zu umreißen eingesetzt , wie es verstanden wird , dass die postnatale Knochenwachstum und fötalen Knochenwachstum unterschiedlich 21 geregelt. Das Knochenwachstum in kultivierten postnatal metatarsals beobachtet wurde, ist jedoch deutlich geringer als bei embryonalen Anfangsgründe beobachtet 25,34, ihr Potenzial in Langzeitstudien zu begrenzen und Hervorhebung der systemischen Einfluss auf das Knochenwachstum in diesem postnatalen Phase. Tatsächlich, 3 Tage alten postnatalen metatarsals von Mäusen , sind in der Regel die letzte Stufe , die verwendet werden können , messbare Wachstums 34 zu erhalten.

Hier beschreiben wir unser Protokoll für die Isolierung von embryonalen Metatarsalknochen an E15. Das Fehlen von hydroxyapaptite Mineral in E15 Mittelfußknochen bedeutet, dass sie ein einzigartiges Modell liefern nur zu untersuchen, nicht die Mechanismen Längsknochenwachstum umgibt, sondern auch die Initiationder Skelettmineralisierung. Die mineralisierte Matrix des Terminals hypertrophen Chondrozyten – Zone bietet ein Gerüst für Osteoblasten zu erlassen , die eine Knochen spezifische Matrix (Osteoid) , die anschließend mineralisiert ist, und als solche dieser ersten Mineralisierung ist von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche und funktionelle Knochenbildung 35 eindringen. Tatsächlich eine Reihe von jüngsten Berichten E15 metatarsals nutzen ihre einzigartige Fähigkeit zur Untersuchung des Mineralisierungsprozess 28,36,37 bestätigt. Darüber hinaus haben Forscher die Verwendung von E15 Metatarsalknochen als Modell der Angiogenese 38, das auf das Potential embryonaler Metatarsalknochen als Modell außerhalb des Knochenwachstums / Mineralisation Einstellung beschrieben.

Das Protokoll wird beschrieben , erfordert nur Standardlaborausrüstung einschließlich einer laminaren Strömungshaube, einem Präpariermikroskop für die Dissektion durchgeführt wird , und einem CO 2 -Inkubator für die Kultur von exzidierten Rudimente. Weiterhin ist eine sehr einfache culture Medium & agr; MEM, BSA, Antibiotika, Antimykotika und L-Ascorbinsäure (ein Co-Faktor bei der Synthese von Hydroxyprolin und Hydroxylysin, zwei essentiellen Aminosäuren für die Herstellung von Kollagen 39) vermeidet die Verwendung von undefinierten Additive, wie tierische Seren , die . Herkömmlicherweise haben Forscher βGP auf Medien hinzugefügt embryonalen Metatarsalknochen Kultur verwendet, aber, wie in unserer Ergebnisse zeigten, ist die Verwendung eines zusätzlichen Phosphatquelle nicht für eine erfolgreiche Mineralisierung in diesem Kultursystem erforderlich. Dies ist eine wichtige Erkenntnis in unserem Streben nach das Verständnis der Mechanismen ECM-Mineralisierung untermauert.

Mittelfuß haben mit Adenoviren enthält , dominant-negative Formen der Smad2 infiziert zu erforschen die Rolle des transformierenden Wachstumsfaktor β in der Regulation der langen Knochenentwicklung 40 vorher. Hier enthüllen wir auch die erfolgreiche Transfektion von Wildtyp E15 Mittelfußknochen mit GFP Viruspartikel, t angibt,Hut lentiviralen Techniken leicht angenommen werden könnte Genexpression in Mittelfuß Kulturen zu manipulieren. In ähnlicher Weise ist die metatarsal Organkultursystem ein ausgezeichnetes Modell, in dem das Wachstum von Knochen von gentechnisch veränderten Mäusen zu vergleichen, um besser die Rolle eines bestimmten Gens in Knochenwachstumsprozess verstehen. Unsere bisherigen Studien haben die Metatarsalorgan Kultursystem verwendet, um die Rolle von Suppressor of Cytokine Signaling-2 (SOCS2) in endochondral Knochenwachstum zu bestimmen. Verwendung Mittelfußknochen von Mäusen in SOCS2 defizient gestellt , daß Wachstumshormon ist in der Lage gezeigt , um ihre Längenwachstum unabhängig von Insulin like growth factor (IGF-1) zu simulieren, im Gegensatz zu Wildtyp – Metatarsalknochen, die Wachstumshormon – Behandlung nicht ansprechen 34, 41. Dies unterstreicht den Umfang, in dem metatarsalen Kulturen manipuliert werden können, um die Auswirkungen verschiedener Gene und / oder exogenen Faktoren auf enchondralen Knochenwachstum zu untersuchen.

Zusammengefasst haben wir detaiführte ein Verfahren für die erfolgreiche Extraktion und Kultur von embryonalen Metatarsalknochen, die manipuliert werden kann, und untersuchten eine Vielzahl von Analysen verwendet. Diese ex vivo – Modell unterhält Zell-Zell- und Zell-Matrix – Wechselwirkungen, sowie Chondrozyten in verschiedenen Phasen der Chondrogenese enthält daher ein physiologisches Modell als Zellen in Monolayer – Kultur oder 3D bereitstellt. Metatarsalorgan Kulturen sind daher ein einzigartiges Modell der molekularen Mechanismen, die für endochondral Verknöcherung für die Untersuchung, und sind von wesentlicher Bedeutung unser Verständnis von Knochenphysiologie und Pathophysiologie zu fördern

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.

Materials

Dissection scissors World Precision Instruments 14393 Autoclave sterilise before use
Dumont #5 tweezers World Precision Instruments 500342 Autoclave sterilise before use
Dumont #4 tweezers World Precision Instruments 500339 Autoclave sterilise before use
SuperFine Vannas scissors World Precision Instruments 501778
Absolute ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17 Dilute to 70% v/v in dH2O
α-MEM without nucleosides Thermo Fischer Scientific  22561021
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3059
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter Merck Millipore SLGP033RS
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate Sigma Aldrich P0378 Add directly to the media prior to experimentation
L-ascorbic acid-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C5080 Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G9422 Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C
Gentamicin Thermo Fischer Scientific  15710049
Amphotericin B Thermo Fischer Scientific  15290018
Nunc cell-culture treated 24-well plates Thermo Fischer Scientific  142475
Polybrene Sigma Aldrich H9268
DAPI Thermo Fischer Scientific  D3571
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Riferimenti

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Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. J. Vis. Exp. (118), e54978, doi:10.3791/54978 (2016).
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