足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em>インビトロ</em

膜近位のタンパク質-タンパク質相互作用を研究することにより^、1関わる内在性膜タンパク質のネイティブ環境を反復するのが困難に挑戦し努力です。これは、界面活性剤可溶化およびプロテオリポソーム中のタンパク質の矛盾した姿勢の必要性に起因しています。これらの問題を回避するために、我々は、内在性膜タンパク質の可溶性ドメインは、Hisタグ融合タンパク質として発現させる戦略を採用しており、これらの可溶性断片は、脂質でNTAニッケル（Ni ^2+）頭部基との相互作用を介して足場リポソームに固定されています表面。これらの足場を使用して、脂質近位タンパク質相互作用は、脂質およびタンパク質組成の範囲にわたって調べることができます。

我々は、ミトコンドリア分裂複合体のアセンブリを管理する重要なタンパク質 – タンパク質相互作用を調査し、このPRを調節する脂質との相互作用を調べるために、この方法を有効に適用していますocess ^2。ミトコンドリア分裂の間、ダイナミン関連タンパク質^1（DRP1）3と呼ばれる保存された膜のリモデリングタンパク質は、エネルギー恒常性、アポトーシスシグナル伝達、およびその他のいくつかを調節する細胞シグナルに応答してミトコンドリア外膜（OMM）の表面に補充され一体的なミトコンドリアのプロセス。 ^{8 –}この大規模な、細胞質ゾルのGTPアーゼは、一体のOMMタンパク質⁴との相互作用を介してミトコンドリアの表面に補充されます。そのようなタンパク質の役割、ミトコンドリア分裂因子（MFF）は、原因in vitroで DRP1と明らか弱い相互作用に解明することは困難でした。それにもかかわらず、遺伝学的研究は、MFFが成功したミトコンドリア分裂^7,8に必須であることを実証しました。本稿に記載される方法は、DRP1、MFFの相互作用を促進し、同時に脂質相互作用を導入することによって、以前の欠点を克服することができました。全体的に、この新規アッセイreveaミトコンドリア分裂複合体の構築を導く基本的な相互作用を導き、この本質的な分子機械の継続的な構造的および機能的研究のための新たなステージを提供します。

現在までに、DRP1とMFFの間の相互作用の検討はMFF ^9、DRP1ポリマー^2,10、および精製することが困難と無傷の膜貫通ドメイン¹¹と、全長MFFを再構成するの異質性の固有の柔軟性によって複雑にされています。私たちは、その膜貫通ドメイン（MffΔTM-彼の_6）を欠いているHisタグMFFを再構成するNTA（ニッケル^2+）足場リポソームを用いて、これらの課題に対処しました。 Eにおいて過剰発現された場合MffΔTMは非常に可溶であったため、この戦略が有利でした。大腸菌 、この単離されたタンパク質は、簡単に足場リポソームに再構成しました。これらの脂質のテンプレートに繋留すると、MFFは、膜の表面上の同一の、外向きの方向性を仮定しました。これらの利点に加えて、カルジオリピンのようなミトコンドリアの脂質は、膜¹¹とMFFの折り畳みおよび会合を安定化させるために添加しました。カルジオリピンはまた、この無秩序地域を安定させ、核分裂機械の組み立てを容易にすることができるDRP1 ^2,12の可変ドメインと相互作用します。

このロバストな方法は、膜近位タンパク質相互作用を評価するために求める将来の研究のために広く適用可能です。追加のテザリング/親和性相互作用を使用することにより、これらの膜の再構成の研究の高度化は、細胞内の膜の表面で見出される付加的な複雑性を模倣するように拡張することができます。これと同時に、脂質組成物は、より正確に、これらの巨大分子複合体のネイティブ環境を模倣するように改変することができます。要約すると、この方法は、重要な細胞PROC中に膜形態を形成する上でのタンパク質及び脂質の相対的な寄与を検討するための手段を提供しますesses。