Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
Dendritische Zellen (DCs) sind die wichtigsten spezialisierten Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems. Unreifen DCs (iDC) befinden sich in der Haut oder in Schleimhautgewebe und sind daher unter den ersten Immunzellen mit eindringenden Pathogenen zu interagieren. DCs stellen die Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem 1, da sie T- und B-Zell – Antworten folgende Erregernachweis aktivieren kann. Außerdem tragen sie zur proinflammatorische Immunantworten aufgrund der Sekretion von hohen Mengen von Cytokinen, wie IL-1β, IL-6 und IL-12. DCs aktivieren auch NK-Zellen und ziehen andere Immunzellen an den Ort der Infektion durch Chemotaxis.
DCs können in unreife dendritische Zellen (iDC) und reifen dendritischen Zellen (mDCs) 2 auf der Grundlage ihrer Morphologie und Funktion aufgeteilt werden. Nach der Erkennung von fremden Antigenen durch eine der vielen Mustererkennung Rezeptoren (zB Toll-like – Rezeptoren, C-TypLektine, Rezeptoren oder Komplement) reichlich auf der Zelloberfläche exprimiert, durchlaufen iDCs große Veränderungen und beginnen zu reifen. Während dieser Reifungsprozess, Rezeptoren für Antigen – Capture werden herunterreguliert, während wesentliche Moleküle für die Antigenpräsentation sind drei hochreguliert. Reifen DCs hochregulieren die Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexen I und II (MHC I und II), co-stimulatorische Moleküle, wie CD80 und CD86, die für die Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Lymphozyten wichtig sind. Zusätzlich ist die Expression des Chemokinrezeptors CCR7 auf der Zelloberfläche induziert, die die Migration von DCs aus peripheren Geweben in die Lymphknoten ermöglicht. Die Migration wird durch die "Rollen" von DCs entlang eines Chemokinligand 19 (CCL19 / MIP-3b) und Chemokinligand 21 (CCL21 / SLC) Gradienten in die Lymphknoten 4-6 erleichtert.
Nach der Migration präsentieren mDCs das verarbeitete Antigen CD4 + und CD8 + T – Zellen zu naiv, so initiating eine adaptive Immunantwort gegen das eindringende Pathogen 7. Diese Interaktion mit T – Zellen in den Lymphknoten ist auch mit der Ausbreitung des Virus 8 verbunden. Andere In – vitro – Studien zeigten , dass DCs effizient erfassen und übertragen HIV T – Zellen und dass diese Übertragung führt zu einer kräftigen Infektion 12.09. Diese Experimente unterstreichen , dass in vivo HIV – Exploits DCs als Shuttles von der Peripherie zu den Lymphknoten. Während der Antigenpräsentation, sekretieren DCs Schlüssel Interleukine, die die Differenzierung von Effektor-T-Helferzellen die Form und somit die Ergebnisse der gesamten Immunantwort gegen die Mikrobe in diesem sehr Wechselwirkung bestimmt. Abgesehen von Typ 1 (Th1) und Typ 2 (Th2) Effektor – T – Zellen, andere Untergruppen von CD4 + T – Helferzellen (zB Typ 17 (Th17) und Typ 22 (Th22) T – Zellen) beschrieben wurden, und deren Induktion und Funktion wurden eingehend untersucht. DCs sind außerdem beteiligtdie Erzeugung von regulatorischen T – Zellen (Treg) 13,14. Diese Zellen sind Immunsuppressiva und stoppen kann oder herunterregulieren Induktion oder Proliferation von Effektor-T-Zellen und sind somit entscheidend für die Immunität und Toleranz zu entwickeln.
Menschliche herkömmlichen DCs (cDCs) umfassen mehrere Untergruppen von Zellen mit einer myeloischen Ursprungs (dh Langerhans'schen Zellen (LKS) und dermale und interstitielle DCs) oder lymphatischen Ursprungs (dh plasmazytoiden DCs (pDCs)). Für In – vitro – Experimente oder DC Impfstrategien, Monozyten abgeleiteten DCs sind als Modell für die dermale DCs routinemäßig eingesetzt. Diese Zellen zeigen Ähnlichkeiten in der Physiologie, Morphologie und Funktion zu herkömmlichen myeloischen dendritischen Zellen. Sie werden durch die Zugabe von Interleukin 4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen – Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) an Monozyten isoliert von gesunden Spendern 12,15-18 erzeugt. Dendritische Zellen können auch aus dermalen oder Schleimhaut-Biopsien direkt isoliert werden oder können sogar be von CD34 + hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut erhaltenen Proben ex utero isoliert entwickelt. Hier zeigen wir, wie Monozyten isoliert und stimuliert von antikoaguliertem menschlichem Blut nach Pbmc (PBMC) Anreicherung durch Dichtegradientenzentrifugation. Nach einer Inkubation für 5 Tage, sind menschliche Monozyten unter spezifischen Bedingungen in iDCs differenziert und sind bereit für die experimentellen Verfahren in einem nicht-klinischen Umfeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDCs) durch die Isolierung von humanen Monozyten aus antikoaguliertem Blut eines magnetischen Nanopartikel-basierten Assay. In diesem Protokoll werden die Zentrifugationsschritte stromaufwärts der Zellisolierungsverfahren durchgeführt, was zu einer Anreicherung der PBMC-Fraktion führt. Obwohl Zellen während der Zentrifugation verloren gehen würde, den Inhalt eines Vollblut-Packung auf Dichtegradienten-Medium zu überlagern 2…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
Riferimenti
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
