Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
As células dendríticas (CDs) são as células especializadas apresentadoras de antigénios mais importantes do nosso sistema imunitário. DCs imaturos (iDCs) residem na pele ou nos tecidos das mucosas e são, por conseguinte, entre as primeiras células imunes para interagir com os agentes patogénicos invasores. DCs representam a ponte entre o inato eo sistema imunitário adaptativo 1, uma vez que podem activar respostas T e de células B após a detecção de patógenos. Além disso, contribuem para as respostas imunitárias pró-inflamatórios devido à secreção de grandes quantidades de citocinas, tais como IL-1β, IL-6, e IL-12. DCs também activar as células NK e outras atrair células do sistema imunológico para o local da infecção por quimiotaxia.
DCs pode ser dividido em células dendríticas imaturas (iDCs) e células dendriticas maduras (MDCs) 2 com base na sua morfologia e função. Após o reconhecimento de antigénios estranhos por um dos muitos receptores de reconhecimento de padrões (por exemplo, receptores de tipo Toll, C-tipolectinas, receptores ou complementar a) abundantemente expresso na superfície da célula, iDCs sofrer grandes alterações e começar a amadurecer. Durante este processo de maturação, receptores para captura de antigénios são regulados negativamente, enquanto que as moléculas essenciais para a apresentação de antígenos são up-regulada 3. DCs maduras sobre-regular os complexo principal de histocompatibilidade I e II (MHC I e II), moléculas co-estimuladoras tais como CD80 e CD86, que são essenciais para a apresentação de antigénios e a activação dos linfócitos T. Além disso, a expressão de receptor de quimioquina CCR7 na superfície da célula é induzida, o que permite a migração de DC a partir de tecidos periféricos para os nodos linfáticos. A migração é facilitada pela "rolamento" de DC ao longo de um ligando de quimiocina 19 (CCL19 / MIP-3b) e o gradiente de ligando de quimiocina 21 (CCL21 / SLC) para os nódulos linfáticos 4-6.
Após migração, mDCs apresentar o antigénio processado a ingénuo células T CD4 + e CD8 +, assim initiating uma resposta imune adaptativa contra o agente patogénico invasor 7. Esta interacção com as células T em nódulos linfáticos, também está associada com a propagação do vírus 8. Outros estudos in vitro revelaram que DCs eficiente capturar e transferir HIV às células T e que esta resultados de transmissão de uma infecção vigorosa 9-12. Este estudo destacou que in vivo explora DCs HIV como shuttles da periferia para os gânglios linfáticos. Durante a apresentação de antigénio, as DCs segregam interleucinas chave que definem a diferenciação de células T auxiliares efectoras, e, portanto, o resultado de toda a resposta imunitária contra o micróbio é determinada nesta interacção muito. Além de tipo 1 (Th1) e tipo 2 (Th2) T efetoras, outros subconjuntos de células CD4 + T helper (por exemplo, tipo 17 (Th17) e Tipo 22 (células Th22) T) têm sido descritas, e sua indução e função foram investigadas exaustivamente. DCs são, além disso, envolvido ema geração de células T reguladoras (Tregs) 13,14. Estas células são imunossupressor e pode parar ou para baixo-regular indução ou proliferação de células T efetoras e são, portanto, crucial para o desenvolvimento de imunidade e tolerância.
DCs convencionais Humanos (CDCs) compreendem vários subconjuntos de células com uma origem mielóide (isto é, células de Langerhans (LCS) e dérmica e DCs intersticiais) ou uma origem linfóide (isto é, as DCs plasmocitoides (PDCs)). Para as experiências in vitro ou estratégias de vacinação DC, DC derivadas de monócitos são rotineiramente utilizado como um modelo para as DCs dérmicos. Estas células apresentam semelhanças na fisiologia, morfologia e função às células dendríticas mielóides convencionais. Eles são gerados por meio da adição de interleucina 4 (IL-4) e de granulócitos-macrófagos fator estimulador de colónias (GM-CSF) para monócitos isolados a partir de dadores saudáveis, 12,15-18. As células dendríticas também podem ser directamente isolados a partir da derme ou da mucosa biópsias, ou pode até mesmo be desenvolvido a partir de células progenitoras hematopoiéticas isoladas a partir de amostras de sangue do cordão umbilical obtidos ex utero CD34 +. Aqui, demonstramos como monócitos são isolados e estimulados a partir de sangue humano anti-coagulado, depois de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de enriquecimento por centrifugação em gradiente de densidade. Após incubação durante 5 dias, monócitos humanos sob condições específicas são diferenciados em iDCs e estão prontos para os procedimentos experimentais em um ambiente não-clínico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) através do isolamento de monócitos humanos a partir de sangue anti-coagulado usando um ensaio baseado em nanopartícula magnética. Neste protocolo, os passos de centrifugação são realizados a montante do processo de isolamento de células, o que leva a um enriquecimento da fracção de PBMC. Embora as células são perdidas durante a centrifugação, para sobrepor o conteúdo de um saco de sangue inteiro no meio de gradien…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
Riferimenti
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