マウス内耳に標的薬の配布方法の比較研究：Bullostomy<em>対</em> Transtympanicインジェクション

動物の取り扱い手順は、国際および国内の規制に従っていることを確認してください。プロトコルはそれぞれ、欧州共同体63分の2010 / EUとスペイン語RD 2013分の53のガイドラインに従っています。 1.一般的な動物の取り扱い標準食や飲料水でマウスを自由にフィード。実験動物学協会のための連合（FELASA）の勧告に従うことによって制御の健康と幸福。 2.聴覚評価注：このようなABR 9などの非侵襲的処置で（この作業2、7、14および28日のpostmicrosurgeryに）手術後の前にテストの公聴会によって顕微手順の機能的影響を追跡し、何度も。 ABR試験のため、10（腹腔内ケタミン注射（100 mg / kg体重（BW）とキシラジン、すなわち短期間効果プロトコルでマウスを麻酔ミリグラム/キログラム、BW）。また、吸入麻酔下で聴力検査を行います。 注：ABRパラメータは麻酔プロトコル28によって影響を受ける可能性があるので、実験を通じて同じものを使用します。 つま先ピンチ反射をテストすることによって、麻酔の深さを確認してください。 注：引っ込め反射が消えると、動物が聴覚テストを実行するために、麻酔の適切な深さに達しています。 そのようなヒドロキシプロピルメチルセルロースベースのゲルなどの涙サプリメント、の局所投与により乾燥し、二次乾性角結膜炎から目を保護します。 全体の手順の間に生理的温度（37.5から38℃）で、マウスを保管してください。電気的な干渉を避けるために、暖かい水ポンプと加熱パッドを使用してください。直腸プローブを用いて体温を監視します。常に動物が過熱しないように注意してください。 注：我々は、マウスとの間の表面消毒剤で加熱パッドをクリーニングすることをお勧めします。0は、麻酔導入および回収、電気加熱パッド、白熱灯または赤外光を用いることができます。 ABR手順 注：ABRの登録については、波形作成するために、船内サウンドカードとコンピュータ・ワークステーションを使用します（アナログとデジタルを、DA出力、変換）や電気応答波形をデジタル化するためには、減衰器、オシロスコープと（デジタル、AD入力にアナログ）低インピーダンス増幅器。現代聴覚ワークステーション（ すなわちタッカーデービスTechonologies）は、単一のコンパクトなシステムでは、これらすべてのコンポーネントが含まれています。 周囲のノイズ干渉や残響（ 図1）を回避するために、音減衰チャンバー内の加熱パッドの上にうつ伏せに麻酔をかけたマウスを置きます。 外耳道に音​​響刺激を提供します。プリセットの刺激や適切なソフトウェアに設計された新しい信号を使用してください。選択したスピーカーにDAワークステーションの出力を接続します。 注：FRE外耳道に挿入された電界または閉じた磁界のスピーカを使用することができます。なぜなら閉鎖系におけるプローブ挿入と音キャリブレーションの難しさのマウスで作業する場合、前者が好ましいです。フリーフィールドスピーカーは両耳を刺激し、バイノーラル応答を誘発します。自由音場スピーカーと、主にモノラル応答を得るためには、反対側の活動は、（耳栓とIE）やノイズをマスクすることにより閉塞することによって排除されなければなりません。 外耳道に整列し、スピーカーの中心とヘッドまたは選択した耳に直面して一定の距離（通常は5〜20センチメートル）で自由音場スピーカーを配置します。障害物がスピーカーと耳の間と耳介が完全に開放されていることではないことを確認してください。 次のようにステンレス鋼皮下針電極を配置した：i）頭蓋骨の頂点の上に耳の間の頭皮に積極的に（正）極（）、ⅱ）参照（負）極を、耳下腺に耳介の下の領域、およびiii）背中、尾または後肢地域の接地電極（ 図1）。 正極と負極に電気インピーダンスを確認してください。インピーダンスが3未満キロオーム（理想的には1キロオーム）であることを確認してください。それが高い場合は、アルコールできれいに、再配置または電極を交換してください。 ABRの記録のために、ブロードバンドをクリックすると、純粋なトーン周波数5〜10 dBのSPLは27、29、30ステップにおける音圧レベル（SPL）に90〜10デシベルから強度を低下させるに存在を生成します。 現在の簡単なクリックまたは音が刺激（1-5ミリ）高レベル（ すなわち 80または90デシベルSPL）で始まるし、5〜10 dBのSPLの段階で強度を低下させるバースト。刺激後の最初の10ミリ秒での電気的応答を登録する（ABR応答が6-8ミリ秒で表示される誘発）。 注：このため、刺激率50刺激/秒（通常レート20-50）よりも大きくすべきではありません。 増幅し、記録し、各刺激と強度に誘発電気的応答を平均します。低ノイズと良好な信号対雑音比を持つアンプを使用し、AD入力に接続します。 注：のABRは、典型的には、（ピーク・ツー・ピーク）1μVの下に、非常に低い振幅を持っており、非常に低ノイズでアンプを使用して記録しておく必要があります。しかし、高品質の録音を得るために、200応答、または聴覚障害の場合には、以上の繰り返しは（750-1,000）27を推奨している-健聴マウスでは、明確なABR波は100を平均した後に出てきます。 視覚テスト中にABR閾値を決定します。 注：ABR閾値は、私が2 SD平均バックグラウンドアクティビティ31以上のIVはっきりと見えると中程度のピーク・ツー・ピーク電圧に音波を記録する信頼性の高いABRを誘発させる最低音刺激強度です。このデータは、デュを確認しなければなりませんピークとinterpeak待ち時間を含む他のパラメータと共に、オフライン分析を鳴らし、および振幅を振ります。 手動または自動でデータ分析を実行します。 手動分析のために、4-5 ABR波識別（I、II、III … など 。）とピークをマーク（P1、P2、P3 …）と谷（N1、N2、N3 …）各波のため。分析は、スプレッドシートやテキストファイルに、エクスポートデータを完了します。 注：電気的応答を記録するための具体的なソフトウェアは、通常は自動的に解析を行います。追加の測定は、一定の強度（ すなわち 70または80デシベルSPL）または個々のクリックのしきい値（閾値を超えるすなわち 15デシベルSPL）に対する相対強度で応答してABR記録で決定することができます。 適切なソフトウェアを使用して、ABRデータの統計解析を実行します。実験計画に応じて、使用する規格は、主ABRのパラメを比較するt検定または分散分析（ANOVA）をペアリング異なるグループ26、30でメータ。 注：縦断的研究では、多くの機能データ（ すなわち前と顕微手術後の）異なる時間点で、同じ動物から採取されています。この場合、一般線形モデル反復測定試験は、詳細な差異分析を提供します。 3.車両の準備 準備し、無菌条件下で車両のソリューションを使用しています。 注：液体溶液は、通常、耳管を通ってすぐにクリアされます。別の注射可能な送達系は、ハイドロゲルおよびナノ粒子32を含む中耳、薬物の滞留時間を増加させるために使用することができます。 、CGP-ヒドロゲルを調製1.5-2％（重量/重量）キトサン溶液を得た0.2M酢酸中の75％脱アセチル化キトサンを溶解します。この液7に9％のグリセロリン酸（重量/重量）を追加します。溶液を調製します投与直前、使用するまで4℃でヒドロゲルを保存します。 注：CGP-ヒドロゲルはこの温度で適度に粘性が、それでも注射可能です。 4℃以下では、そのアプリケーションをブロックし、固相に変化します。適用後、CGPは、37℃で約15分で半固体ゲルへの相転移を受けます。 使用するまで4℃でアリコート（0.5mL）を商業RLバッファとストア。 4.顕微手続き 吸入薬（ すなわちイソフルラン）に続いて、鎮静剤や鎮痛薬のケタミンベースの組み合わせで（ すなわち、ケタミンを100mg /キログラム、メデトミジンは0.05mg / kg及び0.025ミリグラム/キログラムphentanile）の腹腔内注射により全身麻酔を誘導します。 注射用薬剤を投与した後、マウスの鼻に麻酔フェイスマスクを調整し、イソフルラン蒸気にO 2供給を接続してください。中に吸入麻酔を維持顕微手術とは、つま先ピンチ反射と呼吸パターンと麻酔面を監視します。反射が全廃され、マウスは、通常の呼吸を提示したときに外科手術の準備を開始します。 全体の手順の間に加熱パッドと体温を維持し、ヒドロキシプロピルメチルセルロースベースのゲルで角膜角膜炎から目を保護します。 滅菌ドレープを使用して、きれいな手術領域を準備します。手術前にガラスビーズ滅菌器で顕微楽器を滅菌します。全体の外科的処置中の無菌状態（滅菌手袋、ドレープ、手術器具など ）を維持します。 マイクロサージェリー Bullostomy 注：Bullostomyは一方的な手順です。マウスの片方の耳を操作し、コントロールとして反対側の耳を使用しています。 褥瘡仰臥位でマウスを置きます。にバリカンを使用して、首の腹側表面に手術領域を準備します毛皮を削除します。ポビドンヨード基づく消毒液で皮膚をきれいにし、滅菌ドレープでそれをカバーしています。 メスを使用して、鎖骨の下顎骨から2センチメートル縦切開を行います。 手術用顕微鏡で拡大して、顎下腺を識別し、鉗子で両方を区切ります。顎下腺を撤回し、二腹筋や顔面神経の起源をローカライズします。 鼓室胞の基礎となる劣る-内側面を露出させ、はさみで二腹筋の起源の切開を行い、腹側にそれを撤回。 27 G針（ 図2A）と、それに穿孔することによって水疱に開口部を作ります。それにあぶみ骨動脈およびRW膜尾側（ 図2B）をローカライズします。吸収性ゼラチンスポンジと掘削領域から血液をきれいにしてください。 34 Gカテーテル及びガラスマイクロシリンジを用いてゆっくり3-5μを注入RWのニッチへの直接bullostomyを介して車両用溶液（CGP-ヒドロゲルまたはRL）のL、それ（ 図2C）を満たします。組織接着剤の1〜2滴でbullostomyを封印。 彼らの初期位置に顎下腺を返し、5-0絹縫合糸で皮膚切開を閉じます。クロルヘキシジンベースの切開部の周り防腐創傷感染を避けるためにを適用します。注：吸収性および非吸収性縫合糸を使用することができます。非吸収性縫合糸は2週間後に除去されなければなりません。その使用は切開感染と局所組織反応と関連しているので、シルクは、皮膚閉鎖のために推奨されません。 二国間transtympanic注射 側臥位でマウスを置き、4.3.1.1で説明したように外耳道以下無菌手術領域を準備します。 耳珠とsに近い外側の外耳道の垂直部分で0.5センチメートル縦切開を行います耳介（オプション）の内部皮膚倍ection。 手術用顕微鏡（ 図2E）を使用して、外耳道の終わりに鼓膜を見つけて、槌骨の柄によって前部と後部のセクションに分割され、上部PARS flaccidaと劣るPARS tensaを識別する（ 図2F） 。 PARS flaccidaの尾の部分に小さなmyringostomyしてください。注射33の間に空気の排出を可能にするために、鼓膜の扁平部tensaに追加の切開を行います。静かに車両の10〜15μL（CGP-ヒドロゲルまたはRL）中耳は明らかに一杯になるまでRWのニッチに近いPARS flaccida、34〜Gカテーテルに接続されたガラスマイクロシリンジで溶液を注入します。 4.3.1.7で説明したように5-0絹縫合糸で皮膚切開を閉じて、きれい。 その反対側およびoper上でマウスを置きます反対側の耳を食べた（4.3.2.5 4.3.2.1-にステップ）。 それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで加熱パッド上でマウスを保管してください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。 身体状態、活動と痛みやストレスの兆候の有無を監視します。 （ すなわち、ブプレノルフィンは0.05mg / kgで、カルプロフェンは5〜10mg / kg）を必要に応じて鎮痛剤を提供します。毎日の手術創を確認し、傷が治癒したことを確認した後、術後7~14日皮膚の閉鎖を削除します。 蝸牛細胞構築の5形態学的評価手術の長期の効果を研究するために腹腔内ペントバルビタールの過剰投与（100mg / kg）で、（このワーク28日postmicrosurgeryで）実験の終了時に、マウスを安楽死させます。 冷たい0.1 Mリン酸緩衝でtranscardial灌流を行います生理食塩水（PBS）、pH7.5で、26は、説明したように0.1 M PBS、pH7.5中の4％（重量/体積）パラホルムアルデヒド（PFA）が続きます。 注意：パラホルムアルデヒドは非常に有毒です。皮膚、目や粘膜との接触を避けます。測定し、準備中に粉末の吸入を避けます。 前庭と内耳の蝸牛成分を分離することなく、34、35に記載されているように 、側頭骨から内耳を分析する実体顕微鏡を使用してください。 穏やかに振盪しながら12時間、4℃で0.1 M PBS、pH7.5中4％（重量/体積）PFAで孤立した内耳を修正しました。 0.1MのPBS、pH7.5で5分間の洗浄3回。 EDTA溶液を3日毎に変え、一定の振とうしながら10日間4℃で0.1 M PBS、pHを6.5に調製した10％エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を有する試料を脱灰。 蝸牛がソフト一貫性を獲得すると、EDTAを除去し、0.1 M PBS、pHが7.5、ウィスコンシン州で5分間、3回洗浄RTで振盪番目。 説明34としてパラフィンワックスでサンプルを埋め込み、厚さ7μmの蝸牛のセクションでは、蝸牛軸に平行にします。 蝸牛細胞構築、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）30で染色切片を評価し、4Xおよび20Xレンズで画像をキャプチャするデジタルカメラに接続した光学顕微鏡を使用します。 6.蝸牛遺伝子発現 RNアーゼ除染液と作業面と手術器具を清掃してください。 5.1で説明したように、マウスを安楽死させるとすぐに顕微鏡を用いて、側頭骨から内耳を解剖します。リボ核酸（RNA）プロテクタおよび安定化試薬を含むガラス皿の中の内耳を浸し。 宝石商の鉗子で残りの錐体骨を外し、そっとヴァンナアイはさみ35を使用して、前庭から蝸牛を分離します。 すぐにTRANSFえー80μLRNAプロテクターと安定剤溶液2 mLのマイクロ遠心チューブに蝸牛、ドライアイスでチューブを配置することによって、組織を凍結します。使用するまで-70℃で蝸牛のサンプルを保持します。 35に記載されているように蝸牛RNAを分離し、分光光度的にその質と量を決定します。 逆転写市販のキットを用いて、全マウスRNAの等量から蝸牛のcDNAを生成します。 遺伝子転写物35、36を測定するために三重に相補デオキシリボ核酸（cDNA）を増幅するためのqRT-PCRを実行します。 注：この作業プロとIL1B、IL6、TGFB1、TNFA、IL10およびDUSP1の抗炎症性遺伝子の転写産物で測定しました。 正規化基準遺伝子レベルの算術平均及び相対的定量化対象転写サイクル閾値（Ct）のレベルを正規化し、相対発現比を計算します問題のグループキャリブレータ群37の算術平均に転写レベル。