The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.
Lymfocytter svare på en rekke stimuli ved å aktivere intracellulære signalreaksjonsveier, noe som i sin tur fører til rask cellulær proliferasjon, migrering og differensiering og cytokinproduksjon. Alle disse hendelsene er tett knyttet til den energistatus i cellen, og derfor studere trasé energi-produserende kan gi hint om den samlede funksjonalitet av disse cellene. Den ekstracellulære flux analysator er en vanlig enhet for å vurdere resultatene av glykolyse og mitokondriell respirasjon i mange celletyper. Dette systemet har blitt brukt til å studere immunceller i noen publiserte rapporter, men en omfattende protokoll optimalisert særlig for lymfocytter mangler. Lymfocytter er skjøre celler som overlever dårlig i ex vivo forhold. Ofte lymfocytt undergrupper er sjeldne, og arbeider med lave celle tall er uunngåelig. Dermed er en eksperimentell strategi som løser disse problemene nødvendig. Her gir vi en protokollsom gir mulighet for hurtig isolering av levedyktige lymfocytter fra lymfevev, og for analyse av deres metabolske tilstander i det ekstracellulære fluks analysator. Videre gir vi resultatene av eksperimenter hvori de metabolske aktiviteter for flere lymfocytt-undertyper på forskjellige celletettheter ble sammenlignet. Disse observasjoner tyder på at våre protokoll kan benyttes for å oppnå konsistente, godt standardisert resultater selv ved lave cellekonsentrasjoner, og dermed kan det har brede anvendelser i fremtidige studier som fokuserer på karakteriseringen av metabolske hendelser i immunceller.
Den immunrespons mot antigener er en stramt regulert balanse mellom aktivering av immunsystemet og immunsuppresjon. Aktivering av immunsystemet driver hurtig celleproliferasjon og migrasjon, samt cytokinproduksjon, antistoff utskillelse og øket fagocytose i respons til sentralstimulerende, mens immunsuppresjon bare hemmer disse hendelsene og er derfor viktig for å hindre unødvendig immunresponser 1-6. Nyere studier har vist at en direkte sammenheng mellom aktiveringsstatusen til immunceller og aktiviteten av forskjellige metabolske veier 7. Immunceller kan skifte mellom hvile og aktiverte tilstander ved å bytte energibanene produsere på og av. Videre har det blitt observert at forskjellige immuncelletyper kan bruke forskjellige metabolske strategier for å drivstoff sine økt energibehov under aktiveringen. For eksempel, mens aktivering av T-lymfocytter retning og celler til en nesten fullstendig glykolytisk tilstand 8 </sup>, aktiverte B-lymfocytter bruke en balanse mellom glykolyse og oksidativ fosforylering 9,10. Disse studiene peker på viktigheten av å undersøke effekten av immuncelleaktivering på cellenes stoffskifte.
Sanntid, samtidige målinger av oksygenforbruk rate (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR), som indikatorer på oksidativ fosforylering og glykolyse, er en felles strategi for å møte de statene trasé energiproduserende 11-13. For å oppnå dette, et ekstracellulært fluks analysator, for eksempel Seahorse XF 96, blir rutinemessig brukt. Et slikt instrument kan raskt sammenligne endringer i OCR og ECAR over celletyper eller på ulike stimulerings forhold. Så langt forskjellige celletyper, inkludert immunceller, er blitt undersøkt ved hjelp av disse enhetene. Imidlertid er en optimalisert protokoll spesielt utviklet for immunceller ikke er tilgjengelig.
Immunceller, særlig lymfocytter, avvike fra othennes celletyper i flere kritiske måter. Lymfocytter er skjøre celler som ikke overlever for lang tid i ex vivo forhold 14-16. Dette er et enda større problem når de dyrkes i suboptimal vekstmediet mangler essensielle næringsstoffer, slik som de som brukes i ekstracellulær fluks analyse. I motsetning til makrofager og mange cellelinjer, trenger lymfocytter ikke holder seg til plastoverflater; Derfor er det viktig å feste dem til analyseplaten uten å generere spenning. Endelig kan noen lymfocytsubpopulasjoner være ekstremt sjeldne og høsting dem på de nødvendige, optimale mengder kan være utfordrende 17-19.
Her gir vi en optimalisert protokoll som er spesielt utviklet for lymfocytter. Bruke splenocytes, B-lymfocytter og naive CD4 + T-lymfocytter isolert fra mus milt og lymfeknuter 20, viser vi hva som kjennetegner deres hviletilstand glykolyse og oksidativ fosforylering ved different celletettheter. Dataene ble normalisert for å ta hensyn til forskjeller i de innledende celletallene for hver brønn ved å måle ende analysecellen lysat proteinkonsentrasjoner, som var direkte proporsjonal med antall celler. Vår protokollen ikke bare gir retningslinjer for den raske isolering av levedyktige lymfocytter for ekstracellulære flux analyser, men det gir også mulighet for å jobbe på suboptimale cellekonsentrasjoner uten at datakvalitet.
Protokollen vi utviklet tillatt for effektiv isolering av ren og levedyktig lymfocytt-undergrupper, som deretter ble brukt i ekstracellulære fluks analyse ved forskjellige konsentrasjoner for å evaluere forskjellene i glykolysen og mitokondriell respirasjon ytelse. Denne protokollen er utformet spesielt for lymfocytter og tar for seg spesielle hensyn knyttet til disse celletyper, slik som lav basal metabolsk aktivitet, skjørhet, lav frekvens, og deres manglende evne til å følge analyseplater. Derfor, sammenlignet med tidligere publiserte protokoller 11,12, vår metoden gir en mer praktisk og bedre optimalisert guide for forskere som arbeider innen immunologi. Det er flere viktige skritt i denne protokollen, inkludert å få rene og levedyktige cellepopulasjoner, plating cellene ved optimal samløpet, og standardisere ekstracellulære flux analyse målinger til proteinkonsentrasjonen i hver brønn.
det jegnitial antall celler belagt kan begge bli visualisert ved lysmikroskopi og også kvantifiseres ved å bruke proteinkonsentrasjonsmålinger. Den lineære sammenhengen mellom mobilnummer og proteinkonsentrasjonen bekreftet at proteinkonsentrasjonen kan faktisk brukes som en måte å standardisere virkningene av endringer i celle tall mellom ulike brønner.
Ved å standardisere ECAR og OCR resultater til proteinkonsentrasjoner, viste vi at, til tross for lavere celle konfluens, så få som 2,5 x 10 5 celler / brønn kunne anvendes i de fleste analyser uten at kvaliteten av dataene. Imidlertid er den nedre grense av celler som kan anvendes varieres mellom celletyper og analyser. For eksempel, mens så lite som 1,25 x 10 5 celler kan brukes for B-celle-OCR-målinger, og med 2,5 x 10 5 celler / brønn var ikke nok til å vurdere den glykolytiske resultatene av den samme celletype. Derfor, så lenge som celle nummer er ikke en begrensende faktor, belagt ved spissen90% samløpet, tilsvarer omtrent 5 x 10 5 lymfocytter / brønn, er å foretrekke. Videre optimalisering kan bli nødvendig når celler av forskjellige størrelser, for eksempel på forhånd er aktivert og delvis differensierte lymfocytter-er brukt. I tillegg, ved bruk av tidligere dyrkede primære lymfocytter, kan det være en variasjon i cellenes levedyktighet mellom forskjellige behandlingsbetingelser, noe som ville redusere påliteligheten av proteinkonsentrasjonen som et mål på celletallet siden døde eller døende celler kan også bidra til de målte proteinnivåene . I slike tilfeller kan det være nyttig å sortere levende celler ved flowcytometri før du utfører de ekstracellulære flux analyser.
I våre analyser ved hjelp av ferskt isolerte og svært levedyktige lymfocyttpopulasjoner, fikk vi pålitelige funksjonelle data for både OCR og ECAR målinger. Mens alle celletyper oppførte seg på samme måte i den mitokondrielle stresstesten, slående forskjeller mellom celletyper varobservert i glykolysen stresstest. For eksempel, glycolytic utførelsen av naive T-celler var lav i forhold til splenocytes eller B-celler, og det ble ikke endret med tillegg av oligomycin. Denne observasjonen er i tråd med tidligere publiserte studier 7,30, noe som bekrefter gyldigheten av vår protokoll.
Som konklusjon, vår fremgangsmåte gir en effektiv og enkel måte å teste den metabolske aktiviteten av lymfocytter ved hjelp av et ekstracellulært fluks analysator, og det kan være nyttig i et bredt utvalg av immunologiske studier utforske de metabolske forandringer i immunceller når disse aktiveres, celledifferensiering eller på grunn til sykdoms fenotyper som infeksjon, autoimmunitet og hematologisk kreftsykdom.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Peña for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.
PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
0.5M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 minutes. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 mL conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500mL media, make a total of 12 mL Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
L-Glutamine 200mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
Sodium pyruvate 100mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
HEPES 1M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
Monoject 3 mL Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
2,4 Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100X cocktail, combine with RIPA to form 1X solution for lysis. |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1M and used to dilute Cell-Tak. |