Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs
Summary
A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.
Abstract
Brustkrebs ist die häufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle bei Frauen weltweit. 15 Monate – Lebermetastasen wird in nach oben von 30% der Fälle mit Brustkrebs-Metastasen und führt zu schlechten Ergebnissen mit einer medianen Überlebensrate von nur 4,8 beteiligt. Aktuelle Nagetiermodellen von Brustkrebs Metastasen, einschließlich der Primärtumorzelle Xenotransplantat und spontane Tumormodellen, selten in die Leber metastasieren. Intrakardialer und intralienale Injektion Modelle haben zur Folge Lebermetastasen, aber diese Modelle durch die gleichzeitige Sekundär Ort Metastasierung verwechselt werden kann, oder durch eines geschwächten Immunsystems aufgrund der Entfernung der Milz Tumorwachstum an der Injektionsstelle zu vermeiden. Um der Notwendigkeit einer verbesserten Lebermetastasen Modelle, eine murine Pfortader Injektionsverfahren, das zunächst Tumorzellen liefert und direkt in die Leber entwickelt wurde. Dieses Modell liefert Tumorzellen in die Leber ohne Komplikationen von gleichzeitigen Metastasen in anderen Organen oder Entfernung der Milz. Die Optimierte Pfortader Protokoll verwendet kleine Einspritzmengen von 5 bis 10 & mgr; l, ≥ 32 Gauge-Nadeln und hämostatischen Gaze an der Injektionsstelle zu steuern, um den Blutverlust. Die Pfortader Injektions Ansatz in Balb / c weiblichen Mäusen unter Verwendung von drei syngenen Brusttumorlinien unterschiedlicher metastatischen Potential getestet wurde; Hoch metastasierendem 4T1 Zellen, moderate metastasiertem D2A1 Zellen und niedrigem metastatischen D2.OR Zellen. Die Konzentrationen von ≤ 10.000 Zellen / Injektion führt zu einer Latenzzeit von ~ 20 bis 40 Tage Entwicklung von Lebermetastasen mit den höheren metastasierendem 4T1 und D2A1 Linien und> 55 Tage für die weniger aggressive D2.OR Linie. Dieses Modell stellt ein wichtiges Instrument Brustkrebs Metastasen in der Leber zu studieren, und kann auch auf andere Krebsarten anwendbar sein, die in die Leber darunter Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsen Adenokarzinome häufig metastasieren.
Introduction
Brustkrebs Metastasierung in die Leber
Die Leber ist eine gemeinsame Website von Brustkrebs Metastasen, zusammen mit Knochen und Lunge 1-3. Lebermetastasen bei Brustkrebspatientinnen ist ein unabhängiger prognostischer Faktor für die sehr schlechte Ergebnisse 4,5, als mediane Überleben von Brustkrebspatienten mit Lebermetastasen im Bereich von 4,8 bis 15 Monate 6-9. Im Gegensatz dazu haben Brustkrebs Patienten mit Lungen- oder Knochenmetastasen mediane Überlebensraten von 9 zur 27,4 Monate 8,9 und 16,3 zu 56 Monate 8,10-12 sind. Metastasierung ist ein mehrstufiges Verfahren, bezeichnet als der metastatischen Kaskade, die mit Tumorzelldissemination im Primärtumor beginnt und endet mit Patientensterblichkeit aufgrund der Aussaat und Auswachsen der Tumorzellen innerhalb eines entfernten Organs 13-15 zirkuliert. Nagetiermodellen von Metastasen haben ergeben, dass die metastatischen Kaskade bemerkenswert ineffizient ist, mit nur 0,02 bis 10%zirkulierender Tumorzellen Festlegung manifester Metastasierung 16,17. Ein wesentlicher Engpass von metastasierendem Ineffizienz wird durch die einzigartige Gewebemikroumgebungen an sekundären Standorten diktiert, metastasierendem Nischen 18 genannt, was die Bedeutung des Verständnisses ortsspezifische Metastasierung. Die metastatischen Nische zum Ort des erneuten Auftretens einzigartig ist, und wird teilweise durch Ablagerung von verschiedenen extrazellulären Matrixproteinen 19,20, Infiltration verschiedener Immunzellpopulationen 21-23, und veränderte Gewebshomöostase einschließlich dysregulated Produktion zahlreicher Zytokinen, Chemokine und Wachstumsfaktoren 15,18,24,25. Somit voran ein Verständnis der gewebsspezifische metastatic Nische zu verstehen, wie Metastasen abzuzielen. Allerdings robuste Modelle von Lebermetastasen fehlen. Des Weiteren wird eine verbesserte Modelle von Lebermetastasen zu Identifizierung neuer Ziele und wirksame Behandlungen für Brustkrebspatienten wi wesentlich seinth Lebermetastasen.
Etablierte Modelle Metastasierung von Brustkrebs in die Leber zu studieren
Derzeit verfügbare Modelle Metastasierung von Brustkrebs zu untersuchen, um die Leber menschlichen Krebszelle Xenotransplantate in immungeschwächten Mäusen enthalten. Diese Modelle verwenden in der Regel gut untersuchten menschlichen Brustkrebszelllinien wie MCF-7 und MDA-MB-231 und Nude, Rag1 – / – oder SCID immungeschwächten Maus – Wirte 26-29. Xenograft – Modelle bieten den Vorteil der Menschen abgeleitet Krebszelllinien beteiligt, aber die jüngste Aufwertung für Immunzellen bei der Metastasierung gegeben 30-32 und in der therapeutischen Widerstand 33-35, die Untersuchung der Metastasierung in einem vollständig immunkompetenten Wirt ist von größter Bedeutung. Modelle für Brustkrebs Metastasen in der Leber in immunkompetenten Wirten umfassen orthotope Injektion von syngenen Tumorzellen (zB 4T1 und D2A1 Zelllinien) in das Brustfettpolster, mit oder ohne chirurgischen studierenResektion des Primärtumors und die anschließende Beurteilung der Metastasierung 36-38. Zu beachten ist , ist die Rate von Lebermetastasen aus orthotope Transplantation Modelle sehr gering oder gar nicht vorhanden im Vergleich zu anderen metastatischen Stellen wie Lunge 39,40, oder tritt nach ist Lungenmetastasen festgestellt, die Untersuchung der leberspezifischen Metastasierung zu verkomplizieren 37,39 .
Tumor-Explantate von spontanen gentechnisch veränderten Brustkrebs-Modelle können in die Brustfettpolster von naiven Wirte als syngenen Tumorzellen wieder injiziert werden. Zum Beispiel wurde kürzlich berichtet , dass die spontane Tumoren von K14 Cre ECAD f / f P53 f / f Mäuse, die Modell – invasiven lobulären Mammakarzinom, Tumoren entwickeln , wenn orthotop in Wildtyp- Wirte injiziert. Nach chirurgischer Resektion dieser Tumoren , wenn sie 15 mm 2 erreicht, 18% der Mäuse fortgeschritten , um Lebermetastasen 40,41. Ein dritter Ansatz Lebermetastasen nutzt zu modellierenspontane Metastasierung in gentechnisch veränderten Mäusen. Bis heute Berichte von spontanen murine Modelle von Brustkrebs Metastasen, die leicht auf die Leber ausgebreitet sind selten. Ausnahmen schließen die H19-IGF2, die p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre und die K14 Cre eCAD f / f P53 f / f gentechnisch veränderte Maus – Modellen, in denen Lebermetastasen in einem geringen Prozentsatz von Mäusen entwickelt 38,41- 43. Während also genetisch veränderte Mausmodelle die Untersuchung von allen Stadien der metastatischen Kaskade und bietet leistungsfähige und klinisch relevante Modelle zu erleichtern, sind sie aufgrund der niedrigen Raten von Lebermetastasen 38 begrenzt.
Mehrere Metastasierung Modelle umgehen die ersten Schritte der metastatischen Kaskade einschließlich der Verbreitung von Tumorzellen aus dem Primärtumor und intravasation. Diese Modelle erlauben Untersuchung in die späteren Schritte der metastatischen Kaskade von Extravasation Einrichtung von Tumoren an sekundären Standorten. Der intracardiac Injektions Modell liefert Tumorzellen in den linken Ventrikel, die über die Aorta Tumorzellen in das Kreislaufsystem verteilt. Intrakardial erfordert Ultraschall-geführte Bildgebung der Injektionsstelle oder andere bildgebende Verfahren wie Biolumineszenz von Luciferase-Zellen getaggt erfolgreich Injektion zu bestätigen. Die Tumorzellinjektion über den linken Ventrikel kann in Knochen führen, Gehirn, Lunge und / oder Lebermetastasen unter anderen Organen 44-48. Aufgrund der Multi-Organ Metastasen, müssen diese Mäuse häufig vor der Entwicklung einer manifesten Lebermetastasen eingeschläfert werden, negiert die Fähigkeit zur vollständigen Metastasenwachstum in der Leber zu untersuchen. Ein alternativer Ansatz, der die Entwicklung von Multi-Site-Metastasierung signifikant minimiert, ist die intralienale Injektion Modell. Intralienale Injektion liefert über die Milzvene Tumorzellen , die mit der mesenterica superior verbindet 49,50 die Pfortader zu werden. Die Tiere können für outgr überwacht werdenowth von Metastasen in der Leber , da die Bildung an anderen Standorten von Metastasen ist selten, und als Ergebnis, den allgemeinen Gesundheitszustand des Tieres 49,50 gehalten. Allerdings ist es wichtig , dass das intralienale Modell Splenektomie Milztumoren 49,50, ein Verfahren , die Auswirkungen auf die Immunfunktion zu vermeiden , erfordert zu beachten. So wird beispielsweise myokardiale Ischämie Reperfusionsverletzung durch Infiltration von Ly6C + Monocyten Teilmengen aus , die aus der Milz und sind verantwortlich für die phagozytische und proteolytischen Aktivität während der Wundheilung nach Ischämie 51,52 stammen. Mit Splenektomie, gibt es eine beobachtete Reduktion der Monozyten – Populationen, die in Wundheil 52 unterstützen. Ferner wurde Splenektomie Primärtumorwachstum und Lungenmetastasen in einem nicht-kleinzelligen Lungenkrebs – Modell, und zwar durch eine Verringerung der Anzahl von zirkulierenden und Intratumor CCR2 + CD11b + Ly6C + monozytären myelo zu reduzieren gezeigtid Zellen 53. Zusätzlich führte Splenektomie folgende intralienale Injektion von Kolonkarzinomzellen in reduzierten Mengen an Anti-Tumor – natürlichen Killerzellen in mesenterischen Lymphknoten und erhöhte Lebermetastasen 54. In Summe legen diese Ergebnisse nahe, dass Splenektomie das Immunsystem die Rolle mit weiteren Folgen für metastatischen Zellschicksal Kompromisse.
Pfortader Injection Modell von Lebermetastasen
Um Brustkrebs Metastasen in der Leber in einem vollständig immunkompetenten Wirt, unter Bedingungen, bei denen Mäuse nicht beeinträchtigt werden durch Multi-Organmetastasen, eine Pfortader Injektion Modell untersuchen entwickelt. Intraportale Injektion Modelle wurden zuvor zu studieren Lebermetastasen von kolorektalen 55,56 und Melanom 16 Zelllinien verwendet werden; wir hier Anwendung der intraportale Injektion beschreiben zu syngenen Brusttumorzelle Metastasen modellieren. Dieses Modell kann verwendet werden, um zu studierendie späteren Stadien der metastatischen Kaskade einschließlich Brustkrebs-Zell Extravasation und Säen, Tumorzellschicksal Entscheidungen in Bezug auf den Tod / Proliferation / dormancy und Auswuchs in offene Läsionen. In diesem Modell werden syngenen Brusttumorzelllinien über die Pfortader von immunkompetenten Balb / c weibliche Mäuse, ein Verfahren injiziert , die zunächst Tumorzellen liefert und direkt in die Leber ohne Entfernung der Milz. Um dieses Modell zu entwickeln, die Verwendung von vier Brusttumorzelllinien, die von niedrig bis hoch in ihre metastatische Fähigkeit reichen wurden eingesetzt: D2.OR, D2A1 und 4T1, und haben D2A1 getaggt mit grün fluoreszierende Protein (D2A1-GFP) eingesetzt untersuchen frühen Zeitpunkten nach der Injektion der Tumorzellen. 4T1 ist ein hochmetastatisch vom 410,4 Tumor abgeleitete Zelllinie , die in einem MMTV + weibliche Balb / c Maus 36,37 entstanden spontan und metastasiert auf Lunge, Leber, Gehirn und Knochen von Brust 39,57,58 Primärtumoren Fettpolster. D2A1 Tumorzellen WERe auch ursprünglich aus einem spontanen Mammatumor abgeleitet in einer Balb / c – Host nach der Transplantation von D2 hyperplastischen alveolaren Knötchen Zellen entstehen, und bestätigt aus dem Primärtumor in die Lunge 59,60 metastatic sein. D2.OR Tumorzellen sind eine nicht-metastasierten Schwester Linie auf die D2A1 Linie , und obwohl sie den Primärtumor zu entkommen und an sekundären Standorten kommen, aber nur selten Fernmetastasen 60,61 etablieren.
Darüber hinaus ist es wichtig, die Verwendung von allgemein verwendeten Schmerz Arzneimittel, einschließlich nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs) während oder nach dem chirurgischen Eingriff zu vermeiden. NSAIDs haben Antitumor-Aktivität in bestimmten Brustkrebs 62-65, und einige Klassen von NSAIDs erhöhen das Risiko für Hepatotoxizität 66,67, möglicherweise die Studie von Lebermetastasen zu beeinträchtigen und die Leber metastasiertem Nische. Ferner Studien deuten darauf hin, dass direkt das Gewebe Mikroumgebung beeinflussen NSAIDs, pro-metastatischen ext reduziertracellular Matrixproteine Tenascin-C 68 und fibrillärem Kollagen 62,65. Alternativ wurde wegen seiner Wirksamkeit in rodent Schmerzmanagement 69 und aufgrund des Mangels an Beweisen die Verwendung eines Opioid – Derivat, Buprenorphin, verwendet , dass Opioide 70 Antitumoraktivität aufweisen. Diese Injektion Modell Pfortader wurde für kleinere Injektionsvolumina von 5 optimiert – 10 & mgr; l, um unnötige Schäden an der Leber zu vermeiden. Das Modell wurde auch Nadeln optimiert umfassen mit kleinerem Durchmesser (≥ 32 gauge) und die Verwendung von hämostatischen Gaze unmittelbar nach der Injektion der Blutverlust während des Verfahrens zu minimieren. Im Gegensatz zu diesen optimierten Einspritzparameter, die Zellzahlen sollte auf individueller Basis bestimmt werden, bezogen auf das tumorigene Potential der Zelllinie. Jedoch für Langzeitstudien bei ≤ 10.000 Zellen / Injektion beginnend empfohlen. Für kürzere Endpunkten (beispielsweise 24 h post-Injektion) erheblich mehr Tumorzellen (zB1 × 10 5 – 1x 10 6) kann , falls erforderlich auch verwendet werden. Zusammengefasst detailliert die Pfortader Injektion Modell stellt hier ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Brustkrebs Metastasen in der Leber und umgeht eine Reihe von Einschränkungen anderer Lebermetastasen Modelle. Dieses Modell ermöglicht Untersuchung der Tumorzelle Extravasation, Säen, frühe Schicksal Entscheidungen des Überlebens, Proliferation und Dormanz und metastatischen Auswuchs in immunkompetenten Maus-Hosts.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Balb / c-Maus Pfortader Injektions Modell erlaubt die Untersuchung von Brustkrebs Läsionen in der Leber in der Abwesenheit von Störfaktoren Multiorganmetastasen und in einem vollständig immunkompetenten Wirt. Unser Protokoll ist eine Weiterentwicklung der bisher chirurgische Verfahren veröffentlicht , die zur Injektion von Tumorzellen 16,55,56 direkt in die Leber Zugriff auf die Pfortader ermöglichen. Eine Weiterentwicklung wir gemacht haben , ist signifikant die Anzahl der injizierten Tumorzellen reduzieren von ≥ 1 x 10 5 Zellen / Injektion 16,55,56 unten 10.000 Tumorzellen auf ≤ / Injektion. Wir haben auch das Modell für die Untersuchung von Brustkrebs Metastasen in der Leber erweitert. Mit diesem Protokoll, zwei Brustkrebszelllinien mit bekannten Metastasepotential Lebermetastasen mit kürzerer Latenz als eine Ruhebrusttumorzelllinie zu entwickeln. Ferner werden zu frühen Zeitpunkten, Tumorzellen in der gesamten Leberparenchym als einzelne oder kleine Gruppen von Einzel ce verteiltenlls nach der Tumorzellinjektion. Das Modell ist bereit, Fragen von metastasierendem Effizienz einschließlich Tumorzelle Extravasation, das Überleben der Zellen, Dormanz und Proliferation zu adressieren – alle Phänotypen, die zur Entwicklung von Mikro-metastatischen und offene Metastasen in der Leber beitragen.
Es ist wichtig, zahlreiche Aspekte der Pfortader Injektionsprotokoll vor Beginn der Studien zu berücksichtigen. Sorgfältig Entscheidung über Zelllinien, Zellkonzentration wird die Gesamtzellzahl und Endpunkte von Interesse basierend auf kleineren Sondierungsstudien sehr zu empfehlen. Ferner ist die Verwendung von immunkompetenten Wirten und syngenen Zelllinien von größter Bedeutung Wechselwirkungen Wirtszelle, Tumor für das Verständnis. Der neu entwickelte "glühenden Kopf" Maus , die eGFP und Luciferase aus der vorderen Hypophyse ausdrückt , ist ein wichtiges Instrument Host Reaktionen auf exogene eGFP und Luciferase zur Eliminierung von Proteinen verwendet häufig Brusttumorlinien 75 zu markieren , </sup>. Die Verwendung des "glühenden Kopf" Maus und syngenen markierte Tumorzellen durch IHC einfache Identifizierung der einzelnen disseminierten Zellen und micrometastatic Brennpunkte ohne die Sorge von Entzündungsreaktionen zu eGFP oder Luciferase erleichtern. In ähnlicher Weise sorgfältige Auswahl Schmerz-Management-Strategien minimal Anti- oder Pro-Tumor Wirkung aus dem Drogenbehandlungsschema, um sicherzustellen, wird dringend empfohlen. Kritische Schritte in diesem Protokoll umfassen Aufrechterhaltung sterile Bedingungen während Operationen, die Infektion zu gewährleisten, nicht auftritt, da dies keine Ergebnisse durcheinander bringen wird. Es ist auch wichtig, daß die Nadel richtig in die Pfortader angeordnet wird, um sicherzustellen, dass Tumorzellen in die Leber geliefert werden. Üben Sie das Protokoll mit Farbstoffen wie Indien Tinte wird mit diesem Problem helfen. Das Tumorwachstum an der Hauteinschnittstelle ist der beste Indikator dafür, dass falsche Nadel Platzierung aufgetreten. Schließlich ist es wichtig, dass der Blutverlust aus der Pfortader ausreichend kontrolliert wird und ganz aufhört vor suturing das Tier. Die Verwendung von hämostatischen Gaze verringert erheblich die Gefahr einer unkontrollierten Blutverlust aus der Pfortader nach der Injektion. In unseren Händen, nach Injektion verfahrens Mortalität aufgrund von Blutverlust aus der Pfortader wurde von 30% auf 2% der Mäuse, die mit der Verwendung von hämostatischen Gaze reduziert.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Pfortader Injektion Modell nicht die volle metastatischen Kaskade repliziert, wird aber auf die Untersuchung von Tumorzellen Extravasation, Tumorzellnische Wechselwirkungen folgenden Extravasation und das Tumorwachstum begrenzt. Modelle, die die volle metastatic cascade zur Leber genau nachzubilden, wie beispielsweise bei Patienten auftritt, werden dringend benötigt. Eine zusätzliche Einschränkung des Injektionsmodell Pfortader ist , dass es durch die Auswirkungen der Operation auf dem Host, mit der Wundheilung bekannt auszuwirken Krankheitsprogression 76,77 verwechselt wird.
Die Pfortader Injektion Modell stellt eine Verbesserung gegenüber anderen InjektionsModelle Lebermetastasen, einschließlich intrakardialer und intralienale Modelle zu studieren. Insbesondere ermöglicht die Pfortader Injektions Modell für die Untersuchung eines größeren Bereichs der Krankheitsprogression als der intrakardialen Modell, das oft durch gleichzeitige Metastasen in anderen Geweben beschränkt ist. Ferner wird die Pfortader Modell durch Entfernung der Milz nicht kompliziert, wie in der intralienale Modell durchgeführt wird.
Die Pfortader Injektionsmodell kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Lebermetastasen im allgemeinen erweisen. Lebermetastasen ist die häufigste Ort der Metastasierung in Adenokarzinomen insgesamt mit besonders hohen Raten in Bauchspeicheldrüsenkrebs (85% der Metastasen in der Leber), Kolon und Rektum-Adenokarzinome (> 70%), sowie Magen und Speiseröhre (> 30 %) 1. Obwohl spontan und orthotoper primären Tumormodellen von Pankreas- und Kolon – Adenokarzinome schneller in die Leber metastasieren 78,79 kann die Pfortader Injektion Modell prove nützlich, um den metastatischen Prozess dieser Krebsarten zu verstehen, wie kontrollierte Abgabe von Tumorzellen ermöglicht, biochemische, molekulare und histologischen Beurteilungen zu bestimmten Zeiten nach der Tumorzellenankunft. Zusammenfassend stellt die Pfortader Injektionsmodell eine wichtige Verbesserung gegenüber verfügbaren Lebermetastase Modelle von Brustkrebs, und auch auf die Lebermetastasen Gebiet allgemein anwendbar sein.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Alexandra Quackenbush for assisting with surgical procedures during filming of the video protocol, Hadley Holden for histological support, Sonali Jindal for input on tumor and liver pathology during method development, and Breanna Caruso for critical review of the manuscript. The D2A1 and D2.OR mammary tumor cells were a gift from Dr. Ann Chambers, the D2A1-GFP tumor cells were a gift from Dr. Jeffrey Green, and the 4T1 tumor cells were a gift from Dr. Heide Ford. The OHSU Advanced Light Microscopy Core at the Jungers Center was utilized for imaging. The work included in this manuscript includes funding from NIH/NCI NRSA F31CA186524 (to ETG) and NIH/NCI 5R01CA169175 (to PS).
Materials
| 1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
| Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 – 0.1 mg/kg body weight, 1-2x daily for 72 hours, injected subcutaneously |
| Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 ul injected subcutaneously at incision site |
| anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
| Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
| Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
| Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
| anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
| Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
| DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
| Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
| Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
| Heating Pad, x2-3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
| Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
| Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
| Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
| Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
| Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
| Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
| Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
| Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
| Removable Needle Syringe, 25 ul, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
| Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
| Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12°angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
| Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
| Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
| Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
| Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
| Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
| Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
| Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
| Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |
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