والوريد البابي حقن نموذج لدراسة الكبد الانبثاث من سرطان الثدي
Summary
A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.
Abstract
سرطان الثدي هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان بين النساء في جميع أنحاء العالم. وتشارك الانبثاث في كبد تصل إلى أكثر من 30٪ من الحالات مع الانبثاث سرطان الثدي، ويؤدي إلى نتائج سيئة مع معدلات البقاء على قيد الحياة وسيطة من 4.8 – 15 شهرا. نماذج القوارض الحالية الانبثاث سرطان الثدي، بما في ذلك طعم أجنبي خلية الورم الرئيسي ونماذج ورم عفوية، نادرا ما metastasize إلى الكبد. داخل القلب ونماذج حقن داخل الطحال لا يؤدي في الانبثاث الكبد، ولكن هذه النماذج يمكن أن تتغير نتيجة ما يصاحب ذلك الموقع الثانوي ورم خبيث، أو حصانة للخطر بسبب إزالة الطحال لتجنب نمو الورم في موقع الحقن. لمعالجة الحاجة إلى تحسين نماذج ورم خبيث في الكبد، وهو الوريد البابي الفئران طريقة الحقن من شأنها أن توفر الخلايا السرطانية أولا وبشكل مباشر لوضعت الكبد. هذا النموذج يسلم الخلايا السرطانية في الكبد بدون مضاعفات الانبثاث المتزامنة في الأجهزة أو إزالة الطحال أخرى. الأراضي الفلسطينية المحتلةتوظف imized بروتوكول الوريد البابي حقن كميات صغيرة من 5-10 ميكرولتر، ≥ 32 الإبر قياس، والشاش مرقئ في موقع الحقن للسيطرة على فقدان الدم. النهج البوابة حقن الوريد في BALB / ج إناث الفئران باستخدام ثلاثة خطوط ورم الثدي مسانج متفاوتة تم اختبار إمكانية النقيلي. خلايا عالية النقيلي 4T1، خلايا D2A1 المعتدلة النقيلي، والخلايا D2.OR المنخفضة للالنقيلي. تركيزات ≤ النتائج 10000 خلية / حقن في كمون ~ 20 – 40 يوما لتطوير الانبثاث الكبد مع ارتفاع النقيلي 4T1 وD2A1 خطوط، و> 55 يوما للخط D2.OR أقل عدوانية. ويمثل هذا النموذج أداة هامة لدراسة سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد، ويمكن أن تنطبق على أنواع أخرى من السرطان أن metastasize في كثير من الأحيان إلى الكبد بما في ذلك القولون والمستقيم وسرطانات الغدد البنكرياس.
Introduction
سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد
الكبد هو موقع مشترك للالانبثاث سرطان الثدي، جنبا إلى جنب مع العظام والرئة 1-3. ورم خبيث في الكبد في المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي هو عامل النذير مستقل لنتائج سيئة للغاية 4،5، والبقاء على قيد الحياة وسيطة من مرضى سرطان الثدي مع نطاقات ورم خبيث في الكبد 4،8 حتي 15 شهرا 6-9. في المقابل، مرضى سرطان الثدي مع الرئة أو ورم خبيث العظام لديها معدلات البقاء على قيد الحياة وسيطة من 9 حتي 27،4 أشهر 8،9 و 16،3 حتي 56 شهرا 8،10-12، على التوالي. الانبثاث هي عملية متعددة الخطوات، ويشار إلى أن سلسلة النقيلي، والتي تبدأ مع نشر الخلايا السرطانية في الورم الرئيسي وينتهي فيات المرضى بسبب البذر وثمرة تعميم الخلايا السرطانية داخل الجهاز البعيد 13-15. وقد كشفت نماذج القوارض من ورم خبيث أن تتالي النقيلي غير فعالة بشكل ملحوظ، مع فقط 0.02 -٪ 10تعميم الخلايا السرطانية إنشاء الانبثاث العلني 16،17. وأملت واحد عنق الزجاجة الرئيسي لعدم الكفاءة المنتشر من قبل microenvironments الأنسجة فريدة في المواقع الثانوية، ودعا منافذ النقيلي 18، وتسليط الضوء على أهمية فهم ورم خبيث في مواقع محددة. مكانة المنتشر هي فريدة من نوعها لموقع تكرار، و، في جزء منه، تتميز ترسب متميزة البروتينات المصفوفة خارج الخلية 19،20، تسلل مختلف السكان الخلايا المناعية 21-23، وتوازن الأنسجة تغير بما في ذلك الإنتاج dysregulated العديد من السيتوكينات، كيموكينات، وعوامل النمو 15،18،24،25. وبالتالي، فهم من الأنسجة المتخصصة النقيلي محددة تسبق فهم كيفية استهداف المرض المنتشر. ومع ذلك، ونماذج قوية من ورم خبيث في الكبد ونقص. وعلاوة على ذلك، فإن نماذج محسنة من ورم خبيث في الكبد سيكون ضروريا لتحديد أهداف جديدة وعلاجات فعالة لمرضى سرطان الثدي وايالانبثاث الكبد عشر.
أنشئت نماذج لدراسة سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد
حاليا النماذج المتاحة لدراسة سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد تشمل xenografts الخلايا السرطانية البشرية في مأمن خطر الفئران. هذه النماذج عادة ما تستخدم مدروسة خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية مثل MCF-7 و MDA-MB-231 و عاري، Rag1 – / -، أو في مأمن SCID خطر المضيفين الفئران 26-29. نماذج طعم أجنبي توفر ميزة تنطوي على خطوط الخلايا السرطانية البشرية المشتقة منها، ومع ذلك، وبالنظر إلى الارتفاع الأخير للخلايا المناعية في الانبثاث 30-32 وفي المقاومة العلاجية 33-35، ودراسة ورم خبيث في مجموعة مختصة المناعة بشكل كامل أمر بالغ الأهمية. وتشمل نماذج لدراسة سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد في المضيفين المختصة المناعة حقن مثلي من خلايا الورم مسانج (على سبيل المثال، 4T1 وخطوط الخلايا D2A1) في لوحة الدهون الثديية، مع أو بدون جراحةاستئصال الورم الرئيسي، وتقييم لاحق من ورم خبيث 36-38. وتجدر الإشارة، فإن معدل ورم خبيث في الكبد من نماذج زرع مثلي منخفضة جدا أو معدومة مقارنة بالمواقع النقيلي أخرى مثل الرئة 39،40، أو يحدث بعد إنشاء ورم خبيث في الرئة، مما يعقد دراسة الكبد محدد ورم خبيث 37،39 .
إإكسبلنتس ورم من نماذج سرطان الثدي عفوية وراثيا يمكن إعادة حقن في منصات الدهون الثديية الجنود السذاجة كما الخلايا السرطانية مسانج. على سبيل المثال، أفيد مؤخرا أن الأورام عفوية من K14 لجنة المساواة العرقية ECAD و / و P53 و / الفئران F، النموذج الذي الغازية سرطان الثدي مفصص، وتطوير الأورام عند حقنه orthotopically إلى المضيفين wildtype. بعد استئصال الجراحي لهذه الأورام بمجرد وصولها إلى 15 مم 2، 18٪ من الفئران تقدمت إلى ورم خبيث في الكبد 40،41. وثمة نهج ثالث لنموذج متنفع ورم خبيث في الكبدالانبثاث عفوية في فئران معدلة وراثيا. حتى الآن، تقارير من نماذج الفئران عفوية من سرطان خبيث الثدي التي تنتشر بسهولة إلى الكبد ليست شائعة. وتشمل الاستثناءات H19-IGF2، والبروتين p53 FP / FP-MMTV لجنة المساواة العرقية الواب لجنة المساواة العرقية، وK14 لجنة المساواة العرقية ECAD و / و P53 و / و نماذج الماوس المعدلة وراثيا، حيث يتطور الانبثاث في كبد نسبة منخفضة من الفئران 38،41- 43. وهكذا، في حين تسهل نماذج الماوس المعدلة وراثيا دراسة جميع مراحل سلسلة النقيلي، وتوفير نماذج قوية وذات الصلة سريريا، فهي محدودة بسبب انخفاض معدلات ورم خبيث في الكبد 38.
عدة نماذج ورم خبيث تجاوز الخطوات الأولى من سلسلة النقيلي بما في ذلك نشر الخلايا السرطانية من الورم الرئيسي ودخول الوعاء. تسمح هذه النماذج التحقيق في خطوات لاحقة من تتالي النقيلي، من التسرب إلى إنشاء الأورام في مواقع الثانوية. كثافة العملياتracardiac نموذج حقن يسلم الخلايا السرطانية في البطين الأيسر، التي توزع الخلايا السرطانية في الدورة الدموية عن طريق الشريان الأورطي. حقن داخل القلب يتطلب الموجات فوق الصوتية الموجهة التصوير من موقع الحقن أو طرائق التصوير الأخرى مثل تلألؤ بيولوجي من وسيفيراز الموسومة خلايا لتأكيد نجاح الحقن. ورم حقن الخلايا عن طريق البطين الأيسر قد يؤدي في العظام والمخ والرئة، و / أو ورم خبيث في الكبد، من بين غيرها من الأجهزة 44-48. بسبب الانبثاث الأعضاء المتعددة، تحتاج هذه الفئران في كثير من الأحيان إلى أن يتم التخلص قبل تطور ورم خبيث في الكبد العلني، يلغي القدرة على تحقيق كامل النمو المنتشر داخل الكبد. نهج بديل أن يقلل إلى حد كبير من نمو الانبثاث في مواقع متعددة هو نموذج حقن داخل الطحال. حقن داخل الطحال يسلم الخلايا السرطانية عن طريق الوريد الطحال أن تنضم إلى الوريد المساريقي العلوي ليصبح الوريد البابي 49،50. يمكن رصد الحيوانات لoutgrowth الآفات المنتشر في الكبد لتشكيل الانبثاث في مواقع أخرى أمر نادر الحدوث، ونتيجة لذلك، يتم الحفاظ على الصحة العامة للحيوان 49،50. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن هذا النموذج داخل الطحال يتطلب استئصال الطحال لتجنب أورام الطحال 49،50، وهو الإجراء الذي آثار الوظيفة المناعية. على سبيل المثال، تتميز عضلة القلب إصابة نقص التروية ضخه نتيجة لتسلل مجموعات فرعية الوحيدات Ly6C + التي تنشأ من الطحال وهي المسؤولة عن أكلة والنشاط بروتين أثناء التئام الجروح بعد نقص التروية 51،52. مع استئصال الطحال، هناك انخفاض الملحوظ في أعداد الوحيدات التي تساعد في التئام الجروح 52. وعلاوة على ذلك، وقد تبين استئصال الطحال للحد من نمو الورم الرئيسي والانبثاث الرئة في نموذج سرطان غير زنزانة صغيرة في الرئة، وتحديدا من خلال تخفيض في عدد من تعميم وداخل الورم CCR2 + CD11b + Ly6C + myelo الوحيداتخلايا معرف 53. بالإضافة إلى ذلك، أدى استئصال الطحال بعد الحقن داخل الطحال خلايا سرطان القولون في انخفاض مستويات المضادة للورم الخلايا القاتلة الطبيعية في العقد الليمفاوية المساريقي وارتفاع ورم خبيث في الكبد 54. وباختصار، تشير هذه النتائج إلى أن استئصال الطحال يقوض دور الجهاز المناعي مع العواقب اللاحقة لمصير خلية النقيلي.
الوريد البابي نموذج حقن الكبد الانبثاث
للتحقيق في سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد في مجموعة مختصة المناعة بشكل كامل، في ظل ظروف حيث لا خطر الفئران بسبب الانبثاث الأعضاء المتعددة، وقد تم تطوير نموذج حقن الوريد البابي. وقد استخدمت نماذج حقن Intraportal سابقا لدراسة ورم خبيث في الكبد من القولون والمستقيم 55،56 وسرطان الجلد 16 خطوط الخلايا. ونحن هنا وصف تطبيق حقن intraportal لنموذج مسانج الثدي ورم خبيث الخلايا السرطانية. هذا النموذج يمكن استخدامها لدراسةفي مراحل لاحقة من تتالي النقيلي بما في ذلك سرطان الثدي تسرب الخلايا والبذر، ورم القرارات مصير الخلية بشأن وفاة / انتشار / السكون، وثمرة في الآفات العلنية. في هذا النموذج، يتم حقن مسانج خطوط الخلايا السرطانية الثديية عبر الوريد البابي من المناعة أنثى الفئران BALB / ج المختصة، وهي طريقة من شأنها أن توفر الخلايا السرطانية أولا ومباشرة إلى الكبد دون إزالة الطحال. لتطوير هذا النموذج، واستخدام أربعة خطوط الخلايا السرطانية الثديية التي تتراوح في قدرتها النقيلي من الأعلى إلى الأقل كانوا يعملون: D2.OR، D2A1، و4T1، وقد استخدمت D2A1 ذات الكلمات الدلالية مع الأخضر بروتين فلوري (D2A1-GFP) ل التحقيق في وقت مبكر وقت نقاط بعد حقن الخلايا السرطانية. 4T1 هو خط خلية المنتشر عالية مستمدة من ورم 410.4 التي نشأت عفويا في MMTV + BALB / ج الإناث الماوس 36،37 ومستطير إلى الرئتين والكبد والدماغ والعظام من الثدي وسادة دهنية الأورام الأولية 39،57،58. الخلايا السرطانية D2A1 وره أيضا مستمدة في الأصل من ورم الثدي عفوية تنشأ في BALB / ج المضيف بعد زرع الخلايا D2 العقيدات السنخية المفرطة التصنع، وأكد أن النقيلي من الورم الأساسي إلى الرئة 59،60. الخلايا السرطانية D2.OR هي خط أخت غير المنتشر إلى خط D2A1 و، على الرغم من أنها الهروب من الورم الرئيسي والتوصل إلى المواقع الثانوية، فإنها نادرا إنشاء الانبثاث بعيدة 60،61.
بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم تجنب استخدام العقاقير إدارة الألم استخداما بما في ذلك العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (المسكنات) أثناء أو بعد العملية الجراحية. المسكنات لها النشاط المضادة للورم في بعض سرطانات الثدي 62-65، وبعض الفئات من المسكنات تزيد من خطر تسمم الكبد 66،67، يحتمل المساومة على دراسة ورم خبيث في الكبد ومكانة النقيلي الكبد. وعلاوة على ذلك، تشير الدراسات إلى أن المسكنات تؤثر تأثيرا مباشرا على المكروية الأنسجة، والحد من تحويلة الموالية للالنقيليالبروتينات مصفوفة racellular tenascin-C 68 و ييفي الكولاجين 62،65. بدلا من ذلك، استخدام أحد مشتقات المواد الأفيونية، البوبرينورفين، تم استخدامها بسبب فعاليته في إدارة الألم القوارض 69، ونظرا لعدم وجود دليل على أن المواد الأفيونية لها نشاط مضاد للورم 70. تم تحسين هذا النموذج حقن الوريد البابي لحقن كميات صغيرة من 5-10 ميكرولتر لتجنب أضرار لا داعي لها للكبد. وكان محسن نموذج أيضا لتشمل الإبر مع قطر أصغر (≥ 32 مقياس) واستخدام الشاش لوقف نزيف الدم مباشرة بعد الحقن لتقليل فقدان الدم أثناء العملية. وعلى النقيض من هذه المعلمات حقن الأمثل، ينبغي تحديد أرقام الخلية على أساس فردي، استنادا إلى إمكانية مكون للأورام من خط الخلية. ومع ذلك، ابتداء من الساعة ≤ 10000 خلية / حقن للدراسات طويلة الأجل الموصى بها. بالنسبة لنهايات أقصر (على سبيل المثال، 24 ساعة بعد الحقن) أكبر بكثير من الخلايا السرطانية (على سبيل المثال،1 × 05-01 أكتوبر × 10 6) يمكن استخدامها إذا اقتضى الأمر. وباختصار، فإن نموذج حقن الوريد البابي مفصلة هنا يمثل أداة مفيدة لدراسة الانبثاث سرطان الثدي إلى الكبد وتلتف على عدد من أوجه القصور في نماذج ورم خبيث في الكبد الأخرى. يسهل هذا النموذج دراسة تسرب الخلايا السرطانية وزرع البذور، والقرارات مصير الأولى من البقاء على قيد الحياة، وانتشار، والسكون، وثمرة المنتشر في المضيفين الفئران المختصة المناعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح BALB / ج البوابة الماوس نموذج حقن الوريد دراسة الآفات السرطانية الثديية في الكبد في حالة عدم وجود التباس ورم خبيث الأعضاء المتعددة ومجموعة المختص المناعة بالكامل. بروتوكول لدينا هو النهوض العمليات الجراحية التي تم نشرها مسبقا التي تسمح بالوصول إلى الوريد البابي لحقن الخلايا السرطانية مباشرة إلى الكبد 16،55،56. واحد تقدم لدينا هي لخفض كبير في عدد الخلايا السرطانية حقن من ≥ 1 × 10 5 خلية / حقن 16،55،56 الى ≤ 10000 الخلايا السرطانية / الحقن. قمنا بتوسيع أيضا نموذجا للدراسة الانبثاث سرطان الثدي إلى الكبد. باستخدام هذا البروتوكول، واثنين من خطوط الخلايا السرطانية الثديية مع إمكانية النقيلي المعروفة تطوير الانبثاث الكبد مع الكمون أقصر من خط الخلايا السرطانية الثديية أكثر هامدة. وعلاوة على ذلك، في نقاط زمنية مبكرة، ويتم توزيع الخلايا السرطانية في جميع أنحاء لحمة الكبد كمجموعات واحدة أو صغيرة من اوربا واحدLLS بعد حقن الخلايا السرطانية. تستعد نموذج لمعالجة مسائل الكفاءة المنتشر بما في ذلك ورم الخلايا التسرب، بقاء الخلية، السكون، وانتشار – جميع الظواهر التي تساهم في تطوير المرض المنتشر الصغير المنتشر والعلني في الكبد.
من المهم أن تنظر في جوانب عديدة من بروتوكول حقن الوريد البابي قبل بدء الدراسة. تقرر بعناية على خطوط الخلايا، وتركيز خلية، ومجموع عدد الخلايا، ونهاية النقاط المثيرة للاهتمام على أساس دراسات استكشافية أصغر ينصح بشدة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الجنود المختصة المناعة، وخطوط الخلايا مسانج أمر في غاية الأهمية لفهم التفاعلات الخلية المضيفة للورم. وضعت حديثا "متوهجة رئيس" الماوس التي تعبر عن EGFP ووسيفيراز من الغدة النخامية الأمامية أداة هامة للقضاء على الردود تستضيف خارجي EGFP ووسيفيراز والبروتينات غالبا ما تستخدم لوضع علامة خطوط الثدي ورم 75 </sup>. استخدام الماوس "متوهجة الرأس" ومسانج الموسومة سوف الخلايا السرطانية تسهيل سهولة التعرف على خلايا نشر واحدة وبؤر micrometastatic التي كتبها IHC دون القلق من الاستجابات الالتهابية إلى EGFP أو وسيفيراز. وبالمثل، واختيار استراتيجيات إدارة الألم بعناية لضمان الحد الأدنى المضادة أو تأثير المؤيدة للورم من نظام العلاج من تعاطي المخدرات ويوصى بشدة. وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول الحفاظ على ظروف معقمة طوال العمليات الجراحية لضمان أن العدوى لا تحدث، حيث سيؤدي ذلك إلى إرباك أي نتائج. ومن المهم أيضا أن الإبرة وضعها بشكل صحيح في الوريد البابي للتأكد من أن الخلايا السرطانية يتم تسليم إلى الكبد. وسوف تمارس بروتوكول مع الأصباغ مثل الهند الحبر مساعدة في هذه المسألة. نمو الورم في موقع شق الجلد هو أفضل مؤشر على أن غير لائق إبرة التنسيب حدث. وأخيرا، فمن الأهمية بمكان أن فقدان الدم من الوريد البابي يتم التحكم بشكل كاف ويتوقف مسبق تماما لsuturiنانوغرام الحيوان. استخدام الشاش لوقف نزيف الدم يقلل كثيرا من خطر فقدان الدم غير المتحكم فيها من الوريد البابي بعد الحقن. في أيدينا، وخفض معدل وفيات الإجرائية ذات الصلة بسبب فقدان الدم من الوريد البابي حقن التالية من 30٪ إلى 2٪ من الفئران مع استخدام الشاش لوقف نزيف الدم.
من المهم أن نلاحظ أن نموذج حقن الوريد البابي لا تكرار سلسلة النقيلي كاملة، ولكن يقتصر على دراسة تسرب الخلايا السرطانية، الورم التفاعلات خلية المتخصصة التالية التسرب ونمو الورم. النماذج التي تحاكي بدقة تتالي النقيلي كامل للكبد، مثلما يحدث في المرضى، وهناك حاجة ماسة. قيود إضافية من طراز حقن الوريد البابي هو أن مرتبك ذلك بسبب تأثير الجراحة على المضيف، مع التئام الجروح المعروف أن يؤثر تطور المرض 76،77.
يمثل نموذج حقن الوريد البابي تحسنا على حقن الآخريننماذج لدراسة ورم خبيث في الكبد، بما في ذلك داخل القلب ونماذج داخل الطحال. على وجه التحديد، ونموذج حقن الوريد البابي يسمح لدراسة مجموعة أكبر من تطور المرض من النموذج داخل القلب، والتي غالبا ما تكون محدودة بواسطة الانبثاث مصاحبة في الأنسجة الأخرى. وعلاوة على ذلك، ليست معقدة نموذج الوريد البابي عن طريق إزالة الطحال، كما هو الحال في النموذج داخل الطحال.
قد يكون نموذج حقن الوريد البابي أداة مفيدة لدراسة ورم خبيث في الكبد بشكل عام. الكبد ورم خبيث هو الموقع الأكثر شيوعا من ورم خبيث في الأورام الغدية بشكل عام، مع معدلات مرتفعة بشكل خاص في سرطان البنكرياس (85٪ من الانبثاث هي للكبد) والقولون وسرطانات الغدد الشرجية (> 70٪)، وكذلك في المعدة والمريء (> 30 ٪) 1. على الرغم من العفوية ومثلي نماذج ورم الأولية من سرطانات الغدد البنكرياس والقولون metastasize بسهولة أكبر إلى الكبد 78،79، قد الأقليم في الوريد البابي نموذج حقنالبريد مفيدا لفهم عملية النقيلي من هذه السرطانات كما التسليم المراقب من الخلايا السرطانية يسمح تقييمات بيوكيميائية، الجزيئية والنسيجية في أوقات محددة بعد وصوله الخلايا السرطانية. وخلاصة القول، يمثل نموذج حقن الوريد البابي تحسنا هاما على نماذج ورم خبيث في الكبد المتاحة من سرطان الثدي، ويمكن أيضا أن تكون قابلة للتطبيق في الميدان ورم خبيث في الكبد بشكل عام.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Alexandra Quackenbush for assisting with surgical procedures during filming of the video protocol, Hadley Holden for histological support, Sonali Jindal for input on tumor and liver pathology during method development, and Breanna Caruso for critical review of the manuscript. The D2A1 and D2.OR mammary tumor cells were a gift from Dr. Ann Chambers, the D2A1-GFP tumor cells were a gift from Dr. Jeffrey Green, and the 4T1 tumor cells were a gift from Dr. Heide Ford. The OHSU Advanced Light Microscopy Core at the Jungers Center was utilized for imaging. The work included in this manuscript includes funding from NIH/NCI NRSA F31CA186524 (to ETG) and NIH/NCI 5R01CA169175 (to PS).
Materials
| 1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
| Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 – 0.1 mg/kg body weight, 1-2x daily for 72 hours, injected subcutaneously |
| Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 ul injected subcutaneously at incision site |
| anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
| Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
| Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
| Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
| anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
| Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
| DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
| Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
| Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
| Heating Pad, x2-3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
| Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
| Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
| Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
| Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
| Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
| Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
| Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
| Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
| Removable Needle Syringe, 25 ul, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
| Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
| Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12°angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
| Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
| Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
| Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
| Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
| Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
| Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
| Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
| Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |
Riferimenti
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
- Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
- Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
- Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
- Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
- Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
- Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
- Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
- Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
- Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer–a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
- Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature reviews. Cancer. 4, 448-456 (2004).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
- Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
- Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
- Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489 (2014).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15, 73-86 (2015).
- Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
- Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
- Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
- Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
- Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
- Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
- Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
- Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
- Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. , e4260 (2012).
- Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
- Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
- Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677 (2014).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469 (2015).
- Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
- Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., Coligan, J. E. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
- Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
- Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
- Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
- Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
- Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960 (2015).
- Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35 (2016).
- Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
- Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
- O’Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
- Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
- Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
- Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
- Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
- Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
- Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18, 1286-1294 (2012).
- Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32, 39-61 (2013).
