对于神经化学标记用biocytin填充和加工部分的免疫染色

大脑已知在其个别的神经元元件的结构和功能特征的多样性。了解不同的神经元类型的脑功能和病理的作用，需要鉴定和神经元的明确标识。在结构上，由躯体树突位置定义的形态特征决定了一个给定的神经元接收到潜在的输入，而轴突树枝状图案识别潜在的突触后目标。神经元的结构多样性拉蒙以来Ÿ卡哈尔的开创性组织学研究¹天一直赞赏。单细胞记录技术的出现表明，结构不同的神经元也显示在射击模式和突触特性的差异。在结构和生理的多样性中GABA能抑制性神经元^2,3是特别明显。此外，它已成为日益明显的是，structurallŸ类似的神经元可以表达不同的神经化学标记，并显示相应的功能⁴分歧。同样地，具有相同的神经化学标记物的神经元可以具有不同的结构和功能^：5-10。因此，在实践中，神经元的功能特性在网络中的分析和其职位的职责包括限定两形态和神经化学身份。即使靶向特定的神经化学标记物记者鼠标线的出现，通常有必要基于免疫组织^11，以确定形态和亚型的身份。

用于表征记录在急性脑切片的细胞的标准方法是在记录过程中与生物胞素或neurobiotin进行填充，固定在多聚甲醛（PFA）以下的记录的部分中，并用免疫组织化学揭示形态和神经化学。因为节的厚度为切片生理学通常300微米以上，因为大多数抗体失败通过深度穿透一路，切片需要被重新切片至60微米或更小，以允许用于生物胞素和神经化学标记物^12-14同时免疫染色。不幸的是，后方交会费时费力;切片过程中组织的风险损失;并且可导致差分组织皱缩，复杂形态重建。此外，形态的现有知识能帮助缩小候选标记有可能被细胞中表达。我们已修改标准生物胞素免疫组织学协议，以允许部分的串行处理首先为形态的恢复，然后为潜在的神经化学标记物的鉴定。

免疫组织化学是在组织或细胞的抗原分布的研究，可以使用酶，荧光标记，放射性元素，或金胶体颗粒¹⁵被可视化。我的程序nvolves用初级抗体特异性标记和扩增一个或多个特定的抗原，随后通过使用靶向用于可视化的第一抗体荧光第二抗体。由于需要区分各二次抗体的荧光光谱没有重叠，可以同时检查只有抗原的数量有限。因此，形态学的先验知识可以是在选择候选的神经化学标记物对细胞分类是有用的。从概念上讲，已经染色切片的串行处理背后的基本原理是基于免疫标记为一种蛋白质或肽不应与抗原性和随后的免疫标记干扰要结构上独立的肽¹⁶的前提。这种缺乏干扰是由于结合的抗体与抗原上的特定的蛋白质的表位，并因此允许多个抗原在相同组织中同时染色。抗原数reveale通过免疫染色d由需要对荧光第二抗体的非重叠光谱和所需要的目标，在不同物种中产生的抗体个体的抗原，以便消除交叉反应性^17,18限定。虽然这是后面串联而非同时标记推理与可能相互作用，据我们所知，免疫标记对安装部分的一个或多个抗原的完成后尚未见报道免疫染色第二抗原两个不同的抗体。在这里，我们描述了预先染色和安装部的串行免疫染色的方法。而我们详细介绍此过程为形态的，随后通过染色在厚的部分蛋白质/肽标记恢复的串行免疫标记过程中，相同的程序可在标准中使用，薄的组织切片，以及。此外，我们描述了一个切实可行的办法，以填补记录神经元生物胞素和撞出的过程从记录的结束时的电池用电极，以优化轴突和神经元的树突乔木的填充，如在我们最近的工作^6,8-呈现。

此处描述的过程中最关键的优点在于，所记录的细胞的形态可完全恢复并且试图切除或免疫染色切片前成像。虽然与某些抗体的渗透问题可能会导致有必要切除切片进行二次免疫染色，这里详述的程序将消除需要重建从多个部分复杂的神经元，并能避免由于组织损失，差示收缩的问题，这可能会危及重建以下切除。一个额外的优点是，该过程将通过限制免疫染色和重新切片，其中生物胞素填充神经元被回收切片降低成本，时间，精力和昂贵的抗体。最实际的方面是广告可在部分染色月使用上述技术之前进行ditional免疫。特别是，形态学的回收将大大减少从细胞生理数据由于无法获得细胞类型的基本形态特征丢弃的可能性。