SILAC Based protéomique Caractérisation des exosomes du VIH-1 des cellules infectées
Summary
Ici, nous décrivons une méthode de protéomique quantitative en utilisant la technique de marquage isotopique stable par les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) pour analyser les effets du VIH-1 infection sur protéomes exosomales hôte. Ce protocole peut être facilement adapté à des cellules sous différentes contraintes ou infection conditions.
Abstract
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Introduction
De nombreuses maladies humaines, y compris les infections virales, sont souvent associés à des processus cellulaires distincts qui ont lieu dans et autour des cellules affectées. Les protéines, agissant souvent comme les effecteurs cellulaires ultimes, la médiation de ces processus. L'analyse des protéines peuvent souvent fournir des informations précieuses à l'environnement local des cellules affectées et nous aider à comprendre le mécanisme sous-jacent de la pathogenèse de la maladie. Parmi les différentes techniques d'analyse des protéines, la protéomique tient particulièrement grande promesse. Comme un outil puissant, à grande échelle, la protéomique peut fournir une compréhension systémique des processus cellulaires, en particulier dans le domaine de la fonction et l'interaction des protéines. L'analyse des protéines spécifiques est simplifiée grâce au développement des techniques de marquage, qui permettent aux chercheurs de surveiller l'expression de composants cellulaires, en particulier des protéines, dans le site de l'enquête. Bien que de nombreuses analyses protéomiques ont été réalisées au cellulaireéchelle de protéome, caractérisations protéomiques sur des compartiments subcellulaires se sont révélés être particulièrement instructifs 1. Ceci est bien illustré dans les études de HIV-1 infection.
Exosomes, 30-100 vésicules membranaires nm sécrétées par une large gamme de types de cellules 2, 3, sont des composantes essentielles de la communication intercellulaire et de transport moléculaire. Ils ont déjà été découverts à jouer un rôle important dans le processus du VIH-1 en herbe 4, 5. En combinant l' analyse protéomique dissection fonctionnelle, nous avons constaté que les exosomes libérés par le VIH-1 des cellules infectées sont constitués d'une molécule de régulation unique et quantitativement différentes signatures de protéines et de ports qui ont un impact propriétés cellulaires sur des cellules réceptives, y compris l' apoptose et la prolifération cellulaire 6 voisine. Les méthodes sont décrites dans ce protocole,à savoir SILAC (de marquage isotopique stable par les acides aminés dans une culture cellulaire) 7 caractérisation protéomiques à base d'exosomes à partir du VIH-1 des cellules infectées. Des approches similaires peuvent être appliquées à mieux comprendre les autres compartiments intracellulaires pendant la pathogenèse en ajustant le stress expérimental au compartiment ou une fraction d'intérêt spécifique et apporter les changements nécessaires aux procédures décrites.
Compte tenu de l'évolution récente des méthodes protéomiques quantitatives, il y a beaucoup de choix lors de la sélection de la méthode la plus efficace pour une expérience particulière. Parmi ceux – ci sont la iTRAQ base chimique (étiquettes isobares pour la quantification relative et absolue) 8 et le sans étiquette MRM (surveillance de réaction multiple) 9 techniques. Les deux méthodes sont des outils puissants et sont de bons choix pour les réglages spécifiques. Un laboratoire typique travaillant principalement avec des lignées cellulaires, cependant, ces deux méthodes ont relatively des coûts plus élevés et sont plus de temps par rapport à la méthode basée sur SILAC. SILAC est une technique de marquage métabolique à base qui intègre les formes isotopiques non radioactifs d'acides aminés à partir du milieu de culture dans les protéines cellulaires. Typiquement, les expériences SILAC commencent avec deux populations de cellules, par exemple, infectées et non infectées. Chacun est marqué de manière différentielle dans son environnement isotopique spécifique jusqu'à l'étiquetage complet est atteint. Les exosomes marqués de ces cellules sont ensuite soumises à une extraction des protéines. Une fois extraites, les protéines exosomales marquées sont analysées par chromatographie en phase liquide tandem spectroscopie de masse 10. Enfin, les résultats de spectrométrie de masse et les protéines marquées de façon significative sont soumis à des statistiques et bioinformatique analyses ainsi que la vérification biochimique rigoureuse. Nos rapports d'enquête précédents suggèrent que les procédures SILAC / exosomes sont plus appropriés pour les lignées cellulaires que les cellules primaires, comme les lignées cellulaires sont habituellement dans unétat de prolifération active efficace étiquetage isotopique,
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les procédures décrites dans le présent document, nous avons démontré l'application de la technique de SILAC pour étudier l'effet du VIH-1 infection sur le protéome exosomal hôte. Initialement, les cellules infectées et non infectées du VIH-1 sont différentiellement marquée par un isotope. Les exosomes marquées de façon différentielle sont ensuite purifiés avant d'effectuer l'extraction des protéines. Ensuite, la chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem est utilisée p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un supplément ARRA à la Lifespan / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 et K24HD080539 à BR. Ce travail a également été soutenue par le Fonds Lifespan Pilot Research (# 701- 5857), Rhode Island Medical Research Foundation Grant (# 20133969) et NIH COBRE URI / RIH pilote de subventions de recherche (P20GM104317) à ML. Nous remercions James Myall et Vy Dang pour l'aide à la préparation des manuscrits et de la figure.
Materials
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
Riferimenti
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