Realizzazione di un UV-Vis e Raman Spectroscopy Immunoassay Platform
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Immunodosaggi sono utilizzati per rilevare le proteine in base alla presenza di anticorpi associati. A causa del loro ampio utilizzo nella ricerca e ambito clinico, una grande infrastruttura di strumenti e materiali immunodosaggio può essere trovato. Ad esempio, 96 e 384 e lastre di polistirene sono disponibili in commercio e hanno un design standard per ospitare ultravioletti visibile macchine spettroscopia (UV-Vis) di diversi produttori. Inoltre, una vasta gamma di immunoglobuline, tag di rilevamento, e agenti bloccanti per i disegni personalizzati per prove immunologiche come la metodica immunoenzimatica (ELISA) sono disponibili.
Nonostante l'infrastruttura esistente, i kit ELISA standard non soddisfano tutte le esigenze di ricerca, che richiede lo sviluppo immunologico individualizzato, che può essere costoso e richiede molto tempo. Ad esempio, i kit ELISA hanno bassa multiplexing (rilevamento di più di un analita in un momento) funzionalità come di solito dipendono fluorescenza o colmetodi orimetric per il rilevamento. Colorimetrici ed analisi fluorescenti a base hanno limitate capacità di multiplexing a causa di ampi picchi spettrali. Al contrario, Raman metodi spettroscopia basati hanno una maggiore capacità di multiplexing a causa di picchi di emissione strette. Un altro vantaggio della spettroscopia Raman è che i giornalisti Raman esperienza significativamente meno photobleaching di tag fluorescenti 1. Nonostante i vantaggi che i giornalisti Raman hanno più tag fluorescenti e colorimetriche, protocolli per fabbricare test immunologici Raman-based sono limitati. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per preparare sonde funzionalizzati da utilizzare in combinazione con lastre di polistirene per il rilevamento diretto di analiti di analisi UV-Vis e spettroscopia Raman. Questo protocollo permetterà ai ricercatori di adottare un approccio fai-da-te per il futuro il rilevamento multi-analita mentre capitalizzando sulle infrastrutture prestabilito.
Introduction
immunodosaggi panino tipici indirettamente rilevano la presenza di un antigene usando due anticorpi. L'anticorpo di cattura è legato ad una superficie solida e forma un complesso antigene-anticorpo quando in prossimità di un antigene appropriato. Un anticorpo di rilevazione viene quindi introdotto e si lega all'antigene. Dopo il lavaggio, i / antigene / anticorpo resti complessi di anticorpi e viene rilevato dal anticorpo di rilevazione etichettato come mostrato nella Figura 1A. Rilevamento Tipica è fatto da un rivelatore a fluorescenza o colorimetrico, limitando multiplexing a 10 analiti causa di ampi picchi spettrali 2,3. Al contrario, i sistemi basati su Raman hanno molto stretti picchi di emissione con conseguente capacità di multiplexing avanzate con le fonti che sostengono il rilevamento simultaneo di fino a 100 analiti 2,3.
Molte fonti bibliografiche sono disponibili che coprono importanti aspetti relativi alla saggi immunologici 4-6 come passo-passodettagli per creare kit personalizzati ELISA. Purtroppo, questi protocolli sono per il rilevamento a fluorescenza o colorimetrico, limitando la capacità di multiplexing di saggi immunologici personalizzati. Per rispondere a questa esigenza, vi presentiamo una procedura dettagliata per fabbricare l'UV-Vis / Raman immunologico pubblicato in precedenza 7 per un test immunologico diretta come illustrato nella figura 1B.
Questo protocollo comprende la fabbricazione di sonde a base di nanoparticelle di oro funzionalizzato, illustrata in figura 2. La procedura per effettuare le sonde / UV-Vis Raman inizia legandosi reporter Raman alla superficie di nanoparticelle di oro (AuNPs). I AuNPs vengono funzionalizzati con anticorpi che sono associati con polietilenglicole (PEG). Restanti siti di legame sulle AuNPs sono bloccati dal legame metossi tiolo polietilene glicole (MPEG-SH) per AuNPs per evitare la successiva legame non specifico durante l'analisi. Le sonde AUNP preparati sono testati legandosi agli antigenifissato ai pozzetti di una piastra di polistirene come illustrato in Figura 1B. Al lavaggio del piatto, le sonde AUNP vengono rilevati utilizzando la spettroscopia UV-Vis, mentre i reporter Raman associati vengono rilevati con spettroscopia Raman. La combinazione di UV-Vis e Raman spettrale dei dati fornisce due metodi di analisi, migliorando le capacità di questo test immunologico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel protocollo dettagliato, ci sono diversi punti critici da affrontare. Un problema è la scelta di Raman giornalista e nanoparticelle d'oro. Anche se il protocollo è stato scritto per essere adattato per l'uso individuale, il giornalista Raman DTTC è stato utilizzato come esempio. DTTC è un reporter carico positivamente e si lega a superfici come citrato innevate AuNPs carica negativa. Questo protocollo può essere adattato per giornalisti caricati negativamente utilizzando nanoparticelle di oro con una car…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
Riferimenti
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